N-糖组在消化系统恶性肿瘤中的研究

论文摘要

恶性肿瘤是当前危害人类健康的主要疾病之一,早期发现、早期诊断和早期治疗对肿瘤患者预后至关重要。肿瘤的诊断从定性到定量、定位已取得长足发展。甲胎蛋白（AFP）与癌胚抗原（CEA）等是非创性筛查及辅助诊断的代表性肿瘤标志物。但由于恶性肿瘤形成是一种涉及多因素、多基因、多阶段的生物学行为,难以获得共同而单一的特异抗原,因此肿瘤血液诊断学研究是一个不断发展和认识的过程。近年来,糖组学（Glycomics）研究的快速发展为研究肿瘤生物学及相关肿瘤标志物提供了新的契机。糖基化是蛋白质翻译后重要的修饰形式,体内70%的蛋白都属于糖蛋白。细胞发生恶变时,由于糖基化修饰酶类（糖基转移酶、糖苷酶）的失活或某些胚胎时期活跃、成熟期趋于静止的酶被激活,从而引起细胞表面糖类结构的变化。因此,研究这些肿瘤相关糖链的特征性改变,对于肿瘤的早期诊断、进程监测、预后评估以及治疗靶点的寻找都具有重要的意义。基于DNA测序仪的荧光糖电泳（DSA-FACE）技术为我们提供了简单、快速、高通量检测N-糖链的方法,更为寻找新的糖相关肿瘤标志物揭示了一个全新的研究途径。本研究通过大规模临床样本的研究,对我国常见的三大消化系统恶性肿瘤（肝癌、大肠癌和胃癌）发生发展进程中N-糖组图谱的特征性改变进行分析,建立并评价基于N-糖组图谱差异分析的多参数诊断模式（diagnostic model）,旨在提高消化系统恶性肿瘤早期诊断的敏感性和特异性。第一部分:N-糖组在原发性肝细胞癌中的诊断意义及其作用机制研究本研究在分析肝纤维化、原发性肝细胞癌（HCC）和正常对照各组特征性N-糖组图谱基础上,应用logistics回归法建立了两个数学诊断模型用于鉴别肝纤维化和HCC,并用ROC曲线评估各指标的诊断效力。随后另外独立收集477例HCC、62例肝硬化、80例HBV携带者和79例健康对照者血清,用于验证新建诊断模型的效力。鉴于血清N-糖链糖基化水平的改变,与细胞内糖基转移酶的表达水平密切相关,我们应用RT-PCR和Western-blotting方法检测岩藻糖基化相关代谢因子GDP-fuc-Tr在肝癌组织与相应癌旁组织中表达情况。并通过转染GDP-fuc-Tr过表达与沉默重组体,初步探讨其对肝细胞增殖活性的影响。结果表明:新建诊断模型CscoreA与CscoreB在HCC验证组中敏感度均达到80%以上,一定程度上填补了AFP阴性患者缺乏有效诊断的空白;GDP-fuc-Tr在癌与癌旁组织中,mRNA水平表达无明显差异;癌组织与癌旁及正常组织的GDP-fuc-Tr蛋白大小不同,提示可能存在结构差异,但表达量无统计学差异;GDP-fuc-Tr过表达与干扰重组体对肝细胞与肝癌细胞的增殖活性无显著影响。第二部分:建立并评价基于血清N-糖组分析的大肠癌诊断模型在分析大肠腺瘤、大肠癌和健康对照各组的特征性N-糖组图谱的基础上,应用logistics回归方法建立数学诊断模型:CRCglycoA用于鉴别诊断大肠癌与健康对照;CRCglycoB用于鉴别诊断大肠癌与大肠腺瘤;将新建诊断公式分别在回顾性验证组、前瞻性验证组和术后回访组中回代,评估其诊断效力。N-糖组图谱结构分析发现,大肠癌的核心岩藻糖结构丰度总和（sumfuc）低于大肠腺瘤与健康对照,本研究采用凝集素印迹法（Lectin-blotting）捕获血清和组织中的核心岩藻糖蛋白加以证实。并应用RT-PCR方法检测岩藻糖基化相关代谢因子GDP-fuc-Tr和Fut8在癌组织与相应癌旁组织中表达情况。结果表明:CRCglycoA与CEA在建模组中的ROC曲线下面积分别为0.92和0.81。相对临界值为2.5ng/ml的CEA,CRCglycoA的敏感度提高了23%,准确率提高了12%;CRCglycoB与CEA在建模组中的ROC曲线下面积分别为0.81和0.73。相对CEA临界值为2.5ng/ml时,CRCglycoB的准确率提高15%,敏感度提高28%;在回顾性验证组和前瞻性验证组中,与CEA比较,CRCglycoA敏感度提高22-25%,准确度提高12-17.5%。CRCglycoB准确度与CEA相近,敏感度提高30%。CRCglycoA、CRCglycoB值在术后随访组中均明显下降。Lectin-blotting结果证实,大肠癌血清中,LCA结合的核心岩藻糖蛋白低于大肠腺瘤和健康对照组。在组织中,大肠癌总核心岩藻糖蛋白含量低于其配对癌旁组织,但无统计学差异。在mRNA水平,Fut8在肿瘤组织中的表达明显低于癌旁组织,而GDP-fuc-Tr在肿瘤与癌旁组织中的表达无明显差异。第三部分:N-糖组在胃癌诊断中的研究本研究采用DSA-FACE的方法,检测184例研究对象（80例胃癌,25例胃溃疡和89例健康对照）的血清N-糖组图谱,分析比较胃癌、胃溃疡和健康对照各组间特征性改变。在此基础上应用logistics回归方法建立数学诊断模型,用于鉴别诊断胃癌与健康对照,命名为GCglyco,并采用ROC曲线评估其诊断效力。按照TNM分期标准将胃癌分为四期,分析比较N-糖链各峰值在胃癌进展中变化,及其与临床常用的胃癌标志物（CEA、CAl9-9、CAl25、CA72-4等）的相关性。结果表明:胃癌中peak5和peak9显著性升高,而peak2、3、4、6和peak7显著降低;结构分析发现,胃癌总核心岩藻糖基化水平显著低于健康对照组和疾病对照组,该结果与大肠癌中的发现相似。GCglyco和logp5/4的ROC曲线下面积分别为0.937和0.897。与常用胃癌标志物比较,GCglyco的正确率提高24%。logp5/4随着肿瘤的严重程度逐渐升高。相关性分析发现,Peak3、6和sumfuc与TNM成负相关,peak9与TNM成正相关,CEA与多条糖链具有相关性,而CA19-9与peak8成负相关。本研究从肿瘤糖组学这一整体概念出发,寻求各肿瘤之间共性与特性的N-糖改变;将N-糖组分析技术应用于多种消化系统恶性肿瘤的早期诊断中,由此建立各自的数学诊断模型,在一定程度上提高了肿瘤的诊断效力,并分析糖链与临床常用标志物的相关性,为以后建立有效的多参数诊断模型奠定基础;对多种肿瘤的异常核心岩藻糖基化修饰现象作进一步的研究,揭示肿瘤发生发展的机制,为寻找直接的诊断标志物及潜在的治疗靶标提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 常用缩略词表
• 引言
• 第一部分 N-糖组在原发性肝细胞癌中的诊断 意义及其作用机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 建立并评价基于血清 N-糖组分析 的大肠癌诊断模型
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 N-糖组研究在胃癌诊断中的初步应用
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 研究工作小结
• 综述
• 参考文献
• 在读期间发表论文情况
• 致谢