论文摘要
背景肿瘤的发生发展是环境因素与宿主因素相互作用的结果，细胞对致癌物的敏感性和自身突变的修复能力直接影响细胞癌变的几率。DNA聚合酶β（DNA polymeraseβ）是一条39KD的单条肽链小分子蛋白质，该聚合酶高度保守，结构上可分为两部分：8KD的氨基末端和31KD的羧基末端。DNA polβ被认为主要是在碱基切除修复（base excision repair，BER）的过程中填补单核苷酸缺口，包括短片段BER和长片段BER，是目前DNA聚合酶中错配率最高的一种酶，并且在氧化损伤的过程中发挥重要作用。由于DNA聚合酶β（DNA polβ）在催化碱基时的高错误率，故它的表达水平过低、过高、或突变的形成都可引起遗传的不稳定性，造成突变积累，促使细胞的癌变。DNA Polβ的高表达干扰了体内多种修复系统，从而导致DNA突变率和癌症易感性增加；高表达的DNA polβ与肿瘤细胞耐药性以及基因组不稳定性有一定关系。DNA polβ缺陷会降低细胞的DNA碱基切除修复（BER）能力，导致对甲基甲磺酸（MMS）的高敏感性，同时甲基甲磺酸或氧化剂等均可诱导DNA polβ的表达。除了在碱基切除修复中发挥作用外，DNA polβ还涉及细胞周期和细胞分化，可能参与DNA复制、重组、与基因组稳定性的维持、癌细胞对某些药物的耐药性等有关。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近年来发现和发展起来的一门新兴的在转录水平上的基因阻断技术，是一种双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程，在基因功能研究和基因治疗方面已经显示了巨大的应用前景。目的本研究旨在探讨RNA干扰表达载体（small interference RNA expression vector）对食管癌EC9706细胞中DNA polβ基因的抑制作用，通过肿瘤细胞体外实验了解siRNA表达载体能否沉默食管癌细胞中DNA polβ基因及沉默效果，为今后提高肿瘤细胞对药物的敏感性提供了理论依据和实验依据。实验方法利用Invivogen公司提供的计算机设计软件，根据DNA polβcDNA编码序列（M13140），从DNA polβmRNA基因中选择2段19个碱基的特异性序列GGAAGTTTGTAGATGAAGG和TATGAGAGCTCATGCCAAG，分别设计2对66nt的寡核苷酸；每对66nt寡核苷酸退火后形成两端各带BglⅡ和HindⅢ酶切位点的双链；分别将STL1（退火形成的双链DNA片断siRNApolβ448）、STL2（退火形成的双链DNA片断siRNApolβ954）用2.0％低熔点琼脂糖凝胶电泳回收，；分别与pGEM-T easy载体连接，得到克隆重组子pGEM-T-STL2和pGEM-T-STL1；用T4连接酶将目的片段pGEM-T-siRNApolβ448和pGEM-T-siRNApolβ954与线性化的表达载体pSuper.gfp/neo连接；利用PCR扩增法筛选鉴定得到重组的siRNA表达载体pSuper.gfp/neo-siRNApolβ448和pSuper.gfp/neo-siRNApolβ954，并对其进行DNA序列分析。将表达载体pSuper.gfp/neo-siRNApolβ448和pSuper.gfp/neo-siRNApolβ954以及空白载体pSuper.gfp/neo分别转染入食管癌EC9706细胞中，用荧光定量PCR方法检测未转染细胞与转染细胞中DNA polβmRNA表达水平的变化；用流式细胞仪检测未转染细胞与转染细胞的细胞周期变化；用台盼蓝拒染实验检测顺铂、博莱霉素、甲基蓝、双氧水影响下未转染细胞与转染细胞死亡比率的变化。实验结果1．遵循siRNA片段的设计原则，最终确定DNA polβ448-466位（GGAAGTTTGTAGATGAAGG）和954-972位（CCTTCATCTACAAACTTCC）为靶序列。2．siRNA表达质粒载体pSuper.gfp/neo-siRNApolβ448和pSuper.gfp/neo-siRNApolβ954经bglⅡ和hindⅢ双酶切后，酶切产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定出现特异性条带，与预先估计的片断大小一致。3．转染后的EC9706细胞在倒置荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白在细胞内广泛表达，经G418筛选得到稳定表达的细胞。4．DNA聚合酶β基因的mRNA表达水平在转染靶向siRNA的实验组1（转染pSuper.gfp/neo-siRNApo1β448的EC9706细胞）和实验组2（转染pSuper.gfp/neo-siRNApolβ954的EC9706细胞）中较空白对照组和空载体对照组相比均显著降低，统计学方面有高度显著性差异（P＜0.01），实验组2中mRNA表达水平较实验组1显著降低，在统计学方面也存在显著差异（P＜0.05,P=0.37）；空白对照组和空载体对照组中都存在较高水平的polβmRNA表达，二者在统计方面无显著性差异（P＞0.05）；5．实验组1和实验组2细胞的S期都与空载体组和空白对照组有高度显著性差异（P＜0.01），说明转染后细胞的S期比例显著增加，细胞增殖率升高。但实验组1和实验组2之间无差异（P＞0.05），说明EC9706细胞DNA polβ表达水平降低至本研究范围对细胞增殖率没有太大影响。6．顺铂加药组浓度小于60μmol/l时，四组细胞死亡率进行比较没有显著性差异（P＞0.05），随着药物浓度逐渐增加，死亡率开始出现高度显著性差异（P＜0.01）结果有统计学意义。博莱霉素加药组和甲基蓝加药组从各自起始浓度开始，四种细胞死亡比率就存在高度显著性差异（P＜0.01）结果有统计学意义。双氧水加药组药物浓度小于120μmol/l时，四组细胞死亡率进行比较没有显著性差异（P＞0.05），随着药物浓度逐渐增加，死亡率开始出现高度显著性差异（P＜0.01）结果有统计学意义．从而为利用RNA干扰提高肿瘤细胞对药物的敏感性提供初步实验证据。结论1．成功构建出DNA polβ靶向的siRNA真核表达载体pSuper.gfp/neo-siRNApolβ448和pSuper.gfp/neo-siRNApolβ954，二者转染食管癌EC9706细胞后能显著降低细胞polβmRNA的表达，说明构建的2个siRNA真核表达载体对DNA polβ有高效和特异的沉默作用，且前者作用更强。2．初步证实食管癌EC9706细胞中DNA polβ过低水平表达不利于维持细胞的生物学特性，细胞增殖率升高，对药物敏感性增加；通过RNA干扰使DNA polβ表达水平降至合适水平，对抑制肿瘤细胞具有一定效果。