论文摘要
EPHB2基因编码的蛋白EphB2是受体酪氨酸激酶家族的一员,表达于细胞膜,与相邻细胞表面的配体结合介导双向信号转导,在膜蛋白酶水解作用或内吞作用下受体、配体之间的结合被破坏,从而导致细胞间的排斥。早期研究发现EphB2在人类多数肿瘤（包括结直肠癌）中存在表达上调,能通过提升细胞迁移能力和促进血管生成,参与肿瘤的形成和发展。但新近研究却发现EphB2在结直肠腺瘤-癌过渡时期存在不同程度的表达下调,它与结直肠癌的发生、发展密切相关,主要通过与其配体结合介导细胞间排斥（区室化）抑制结直肠上皮细胞癌变及进展。结直肠癌中EphB2表达下调的原因还不清楚。目前,仅发现极少数结直肠癌中存在EPHB2基因的突变、杂合性丢失等遗传学改变。而关于表观遗传学改变也存在一定争议。因此有必要对结直肠癌中EphB2的表达和调控进行进一步的研究。在本研究中,我们采用Western印迹法检测了4株结肠癌细胞EphB2的表达,采用免疫组织化学和Real-time PCR技术检测了13例正常人直肠粘膜组织、30例结直肠癌及癌旁正常肠粘膜组织中EphB2蛋白和mRNA表达水平,证实结直肠癌中EphB2的表达存在不同程度的下调,其表达水平与肿瘤分化程度有关（P<0.05）,分化越差,表达越低。采用甲基化特异性PCR技术检测了上述细胞和标本中EPHB2基因启动子区CpG岛甲基化状态,结果发现无一例存在甲基化。同时采用亚硫酸氢盐修饰后基因组测序技术在所有细胞和其中17例EphB2缺失表达的结直肠癌组织中验证了以上结果。由于转录调控是基因表达调节的重要环节,目前关于EPHB2这方面的研究报道较少。我们首先采用报告基因和荧光素酶检测系统对EPHB2基因启动子进行克隆、鉴定,确定核心启动子位于-425+83区域内,并发现-1174-970区域存在沉默子。生物信息学分析发现这两个区域分别存在转录因子Sp1的结合位点之一GC盒和转录因子c-Rel的结合位点。我们对这两个位点进行突变后发现,GC盒突变后启动子活性较突变前降低了15%左右（P>0.05）;c-Rel结合位点突变后启动子活性较突变前升高了85%左右（P<0.01）。综上所述,结直肠癌中EphB2的表达无论在蛋白还是mRNA水平均存在不同程度的下调,其原因与基因启动子区CpG岛甲基化无关,而与转录调控有关。在结直肠癌中,可能是转录因子c-Rel活化后与沉默子结合,从而抑制了EPHB2基因的转录表达。以上的研究结果为阐明结直肠癌中EphB2表达下调机制提供了新的线索,也有希望为结直肠癌的基因和药物治疗提供新的靶点。
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