福建省四种双联病毒的分子鉴定

论文摘要

双联病毒是一种呈孪生颗粒形态的植物单链环形DNA病毒，至今已在多个国家和地区的多种作物上造成毁灭性危害。自20世纪90年代起，我国华南等地区作物双联病毒病害逐年加重。本文对福建省几种作物和杂草上的双联病毒进行了分子鉴定。在福建省，从胜红蓟、醴肠、三角梅、艾草、叶下珠和辣椒等植物采集了13个呈典型双联病毒病症状的样品，提取其总DNA，用双联病毒的简并引物扩增了病毒基因组部分序列，序列测定表明，13个双联病毒样品可归为四大类：马来西亚辣椒黄脉病毒（Pepper yellow vein Mali virus，PYVMlV），赛葵黄花叶病毒（Malvastrum yellow mosaic virus，MaYMV），中国番木瓜曲叶病毒（Papaya leafcurl China virus，PLCCNV），空心莲子草黄脉病毒（Alternanthera yellow vein virus，AlYVV）。其中FY1、FY2、FY3、FY4、FY5、FY6和F26等7个分离物属于PYVMlV；F09和F21等2个分离物属于MaYMV；分离物F25属于PLCCNV；F22、F23和F24等3个分离物属于AlYVV。F09分离自福建农林大学胜红蓟（Ageratum conyzoides），全序列测定表明，F09 DNA A全长2753个核苷酸，共编码6个开放阅读框（ORFs）。通过基因组比较发现，F09 DNAA与胜红蓟黄脉病毒（Ageratum yellow vein virus，AYVV）各分离物的基因组全长序列同源性最高（89.1％～98.4％），而与其它双联病毒的同源性均在79.6％以下，表明F09是AYVV的一个分离物。利用DNAβ的特异性引物在F09中扩增到全长为1350个核苷酸的DNAβ分子（F09β），F09β的全序列与番茄曲叶病毒TLCV伴随的DNAβ的同源性最高，高达95.6％，而与已报道的其它种类的DNAβ的同源性均低于80.2％。这是首次在福建省发现胜红蓟黄脉病毒的分离物，首次在胜红蓟上发现番茄曲叶病毒伴随的DNAβ分子。测定了分离自醴肠F21、F22、F25、F26的全基因组DNAA。序列比较表明，F21和F22之间的同源性高达92.0％，它们与AlYVV分离物的同源性最高，分别为：92.0％和97.0％，而与其它种类双联病毒的同源性均低于64.4％；F25与PLCCNV-[G4]的同源性最高，为99.1％，而与其它种类双联病毒的同源性均低于66.5％；F26与PYVMlV的同源性最高，为95.4％，而与其它种类双联病毒的同源性均低于66.8％。因此F21和F22为AlYVV的新的分离物，F25为PLCCNV的新的分离物，F26为PYVMlV的新的分离物。这是首次在福建发现双联病毒的复合侵染。同时对醴肠黄脉病进行了生物学传毒试验。以具有典型黄脉症状的醴肠为毒源通过烟粉虱分别接种到醴肠（Eclipta prostrata）、普通烟（Nicotiana tabacum）、本氏烟（Nicotiana benthamiana）、心叶烟（Nicotiana glutinosa）、辣椒（Capsicumfrutescerts）、番茄（Tomato）、棉花（Cotton）、叶下珠（Phyllanthus urinaria）等健康植株。在醴肠上发病最重，表现为严重的黄脉症状；辣椒、普通烟和叶下珠的发病程度次之，其余接种植株发病较轻，在本氏烟上症状不明显。试验证明：醴肠上存在双联病毒的复合侵染；在进行粉虱传毒试验时，几种病毒均可由烟粉虱从带病植株传播至健康植株。本文还测定了分离自三角梅（FY1）和艾草（FY5）的全基因组DNAA。序列比较表明，FY1和FY5之间的同源性高达98.8％，它们与我国浙江大学报道的马来西亚辣椒黄脉病PYVMlV毒的同源性最高，均达95.5％，与其余病毒种分离物的同源性均在78.8％以下。因此，它们为PYVMlV的新的分离物。这是首次报道PYVMlV可以侵染三角梅和艾草。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 引言
• 1. 双联病毒科的分类、寄主范围及介体传播
• 1.1 Mastrevirus
• 1.2 Curtovirus
• 1.3 Topocuvirus
• 1.4 Begomovirus
• 2. 双联病毒的基因组结构与功能
• 3. 双联病毒的侵染过程及传播
• 3.1 双联病毒的复制
• 3.1.1 双联病毒的复制策略
• 3.1.2 双联病毒的复制结构域
• 3.1.3 双联病毒的滚环复制
• 3.2 双联病毒的转录
• 3.3 双联病毒的传播
• 3.3.1 自然传播
• 3.3.2 人工传播
• 4. 双联病毒的变异与命名
• 4.1 Begomovirus/DNA β:一种新型的病害复合体
• 4.2 重组是病毒变异和新的病害产生的重要因素
• 4.3 双联病毒的命名
• 5. 双联病毒其它方面的研究进展
• 5.1 双联病毒在基因工程抗病中的应用
• 5.2 双联病毒作为基因表达载体
• 6. 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 1. 材料
• 1.1 病毒
• 1.2 植物材料
• 1.3 菌株和质粒
• 1.4 供试虫源
• 2. 方法
• 2.1 植物总 DNA提取（CTAB法）
• 2.2 PCR技术
• 2.2.1 反应体系
• 2.2.2 反应参数设置
• 2.2.3 反应后检验
• 2.3 割胶回收
• 2.4 DNA克隆技术
• 2.4.1 连接方法
• 2.4.2 感受态细胞制备方法
• 2.4.3 转化
• 2.4.4 重组克隆的初步筛选和菌液 PCR鉴定
• 2.4.5 提取重组质粒和重组鉴定
• 2.5 测序
• 2.6 Southern blot分析
• 2.6.1 电泳和胶处理
• 2.6.2 转膜（中型毛细管转膜）
• 2.6.3 探针标记（地高辛标记法）
• 2.6.4 预杂交和杂交以及显色
• 3 常用化学试剂分子生物学试剂及仪器
• 3.1 常用化学试剂
• 3.2 分子生物学试剂
• 3.3 主要仪器
• 4 常用缓冲液的配制
• 第三章 福建省几种作物和杂草上双联病毒的PCR快速检测
• 1 材料与方法
• 1.1 毒源
• 1.2 植物总DNA的抽提及纯化
• 1.3 PCR扩增、克隆和序列测定、分析
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第四章 侵染胜红蓟的双联病毒的分子鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 毒源
• 1.2 总 DNA提取
• 1.3 PCR扩增、克隆和序列测定
• 1.4 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 F09病毒基因组 DNAA结构
• 2.2 F09 DNAA与其它双联病毒的同源性比较
• 2.3 F09伴随的DNA β分子结构以及与其它 DNA β的同源性比较
• 3 讨论
• 第五章 侵染福建醴肠的双联病毒的分子鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 毒源
• 1.2 植物总DNA提取
• 1.3 PCR扩增、克隆和序列测定
• 1.4 DNA β和 DNA B组分的寻找方法
• 1.5 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 病毒基因组 DNAA结构
• 2.2 病毒分离物 DNAA与其它双联病毒的比较及分子进化分析
• 2.2.1 病毒分离物 F21、F22与其它双联病毒的比较及分子进化分析
• 2.2.2 病毒分离物 F25与其它双联病毒的比较及分子进化分析
• 2.2.3 病毒分离物 F26与其它双联病毒的比较及分子进化分析
• 2.3 分离物中DNA β和DNA B组分的检测
• 3 讨论
• 第六章 醴肠黄脉病的生物学传毒试验
• 1 材料与方法
• 1.1 毒源
• 1.2 供试虫源
• 1.3 供试植物
• 1.4 接种
• 1.5 植物总DNA的抽提及纯化
• 1.6 Southern blotting检测
• 1.7 PCR扩增、克隆和序列测定、分析
• 2 结果与分析
• 2.1 接种植物表现及症状
• 2.2 500bp特异性片断的检测
• 2.3 Southern blotting检测
• 2.4 近全长DNAA特异性片断的检测
• 2.5 序列分析与同源性比较
• 3 讨论
• 第七章 几种作物和杂草上黄脉病的分子鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 毒源
• 1.2 总DNA提取
• 1.3 PCR扩增、克隆和序列测定
• 1.4 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 基因组DNAA结构
• 2.2 病毒分离物 DNAA与其它双联病毒的比较及分子进化分析
• 2.3 分离物中DNA β和DNA B组分的检测
• 3 讨论
• 总结与讨论
• 参考文献
• 附录I 常见缓冲液的配制
• 附录II Genebank + EMBL序列登录号
• 致谢