论文摘要
研究背景与目的异基因造血干细胞移植（Allo—HSCT）是治疗恶性血液病的有效手段,但是,对于高度危险型白血病,Allo—HSCT后复发率仍然高达81%。如何提升GVL效应,降低移植后复发率是提升高度危险型白血病治疗效果的关键所在。Allo—HSCT中,同种异体反应性自然杀伤（Allo-reactive Natural Killer,Allo-NK）细胞因具有对恶性细胞杀伤的高效性和对受者正常细胞的低损伤性,是GVL效应的重要效应细胞。NK细胞的效应发挥受HLA-KIR等抑制性信号和NKG2DL-NKG2D等活化性信号共同调节,二者对冲后的优势信号决定NK细胞的功能状态。单倍体相合移植中,HLA单倍体相合供者NK细胞表面的KIR和与受者靶细胞表面的HLA分子结合,可传递杀伤抑制信号,抑制了NK细胞对靶细胞的杀伤。针对这一靶点,本研究采用封闭供者NK细胞抑制性KIR表达的方法,人工诱导KIR错配,减少对NK细胞杀伤活性的抑制,以其提升NK细胞抗白血病效应。实验方法第一部分Ly49—H-2信号系统调控NK细胞对肿瘤细胞杀伤效应的体外研究以Balb/C（H—2d）×C57BL/6（H—2b）杂交F1代(H—2d/b)小鼠脾单个核细胞作为NK细胞来源,MACS阳选得DX5+NK细胞。流式细胞仪（Flow cytometry,FCM）检测NK细胞纯度和编辑前、后NK细胞表面Ly49表达。常规培养NK细胞敏感靶细胞YAC-1,LDH释放法用于检测NK细胞对其杀伤活性。以C57BL/6鼠源性红白血病细胞株FBL-3为靶,LDH释放法检测未处理NK细胞组（编辑前NK细胞组）、抗体阻断NK细胞组（14811单抗与NK细胞共孵育）、编辑后NK细胞组（效靶细胞10:1共孵育24h）和抗体阻断编辑后NK细胞组对其杀伤活性。第二部分RNAi-Ly49对NK细胞体外杀伤肿瘤细胞效应的影响F1代鼠NK细胞分离纯化同第一章,编号为124,335,589,91的四条siRNAoligo转染NK细胞,FCM检测干扰后各组NK细胞Ly49C表达以筛选有效siRNAoligo。选取最高抑制组NK细胞,LDH释放法检测其对YAC-1和FBL-3细胞杀伤活性。第三部分RNAi-Ly49对单倍体相合移植模型中NK细胞GVL效应的影响雌性荷白血病C57BL/6鼠为受者,雄性CB6F1小鼠为供者,进行骨髓移植。受鼠随机分为5组,每组10只。移植组在9Gy照射后行F1到C57移植构建单倍体相合小鼠移植模型,观察GVL效应。A组,未处理白血病组B组,单纯照射组C组,照射后单纯移植组,输注骨髓细胞1×107/只D组,照射后移植骨髓细胞和未处理NK细胞,照射后1h输注未处理F1代鼠NK 2×106/只,4h后输注F1代鼠骨髓细胞1×107/只E组,照射后移植骨髓细胞和RNAi-Ly49处理后NK细胞,照射后1h输注siRNA转染后F1代鼠NK 2×106/只,4h后输注F1代鼠骨髓细胞1×107/只。统计学方法本实验数据应用SPSS13.0统计软件进行处理,以均值±标准差（（?）+S）表示,所用统计方法主要包括单向方差分析、独立样本t检验、生存曲线以Kaplan-Meier法制作,以P＜0.05表示差异有统计学意义。结果第一部分Ly49—H-2信号系统调控NK细胞对肿瘤细胞杀伤效应1,分选所得NK细胞杀伤活性测定以小鼠NK细胞的敏感细胞株YAC-1为靶细胞,分选得F1代NK细胞的杀伤活性随效靶比升高而增强,NK细胞的杀伤活性正常。5:1时（24.80±0.85）%,10:1时为（45.95±2.0g）%,20:1时为（60.71±1.04）%,40:1时为（79.54±0.94）%。2,各组NK细胞对肿瘤细胞杀伤效应检测以C57BL/6鼠源性红白血病细胞FBL-3为靶,各组NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性经单向方差分析,组间比较差异有统计学意义（F=228.390,P=0.000）。以未处理NK细胞组杀伤效应（20.57±1.22）%为基线数据,抗体阻断NK细胞组杀伤效应与之相比显著增强（P=0.000）,编辑后NK细胞组杀伤效应与之相比显著减弱（P=0.000）。FCM测得编辑后NK细胞组Ly49C（C57BL/6鼠KIR）表达率为（84.98±1.25）%,与未处理组NK（52.27±2.57）%相比,差异有统计学意义（t=22.927,P=-0.000）。抗体阻断编辑后NK细胞组杀伤效应与编辑后NK细胞组相比,显著增强（P=0.000）。结果显示,Allo-NK细胞可以杀伤YAC-1和FBL-3细胞,二者对效应细胞的敏感程度不同。NK细胞的活化状态由抑制性信号和活化性信号的强度共同决定。肿瘤细胞编辑诱导KJR（Ly49）表达上调可降低NK细胞杀伤活性,以单克隆抗体14B11阻断Ly49抑制性信号通路,促进了对冲信号向激活性信号的偏移,增强了NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。第二部分RNAi-Ly49影响NK细胞体外杀伤肿瘤细胞效应1,转染后各组NK细胞的Ly49C表达转染编号为124、335、91、589的siRNA序列,转染后48h FCM检测NK细胞的Ly49C表达率,分别为（27.48±2.79）%,（52.73±2.14）%,（40.98±4.29）%,（33.26±2.77）%。2,siRNA干扰后NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效应以编号为124的siRNA序列的抑制率最高,达48%。干扰后NK细胞对YAC-1细胞杀伤活性为（58.77±1.60）%（E:T=20:1）,与未处理组（60.71±1.04）%相比差异无统计学意义,（t=1.757,P=0.154）。干扰后NK细胞对FBL-3细胞的杀伤活性达（29.08+2.91）%,与未处理组（20.57+1.22）%相比,差异有统计学意义（t=4.664.P=0.010）。结果显示,体外实验,转染后NK细胞对YAC-1细胞杀伤功能与未处理组NK细胞相比无显著性差异,结果和YAC-1细胞来源品系A/Sn与CB6F1小鼠完全错配相吻合。单倍体相合的FBL-3细胞则显示不同情况,转染后NK细胞KIR表达下调,使NK细胞偏向活化的功能状态,提高了其对FBL-3细胞的杀伤效应。第三部分RNAi-Ly49影响单倍体相合移植模型中NK细胞GVL效应实验各组小鼠存活状态观察A组未作处理,白血病进展迅速,小鼠全部于8-11天死亡,生存时间（9.43±1.06）dB组照射后未做移植,小鼠体重迅速下降,生存时间（9.23±0.40）d,均死于造血衰竭（WBC＜0.5×109/L）C组2只存活超过30天,生存时间（23.88±8.65）d。D组4只存活超过30天,生存时间（30.14±8.56）d,对照未处理组,抑制率=319.62%;对照单纯移植组,抑制率=126.21%。E组5只存活超过30天,生存时间（33.74±6.71）d,对照未处理组,抑制率=357.79%;对照单纯移植组,抑制率=141.29%。结果显示,在荷白血病小鼠模型观察NK细胞的抗肿瘤效应,以生存期为观察指标推算抑制率,设未处理的A组为对照,E组抑制率为357.79%,高于D组38.17%;设未输注NK细胞的C组为对照,D组抑制率为126.21%,E组抑制率高过D组15.08%,达141.29%。说明通过人工诱导KIR错配的方法提高单倍体相合KIR的错配率,进一步提升了NK细胞的GVL效应。结论1.体外功能实验,效应细胞NK的活化状态由抑制性信号和活化性信号的强度共同决定。以单克隆抗体14811阻断Ly49表达和RNAi-Ly49干扰抑制性信号通路传导,促进了对冲信号向激活性信号的偏移,增强了NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。2.体内实验,荷白血病小鼠模型观察NK细胞的抗肿瘤效应,以生存期为观察指标推算抑制率:设未处理的A组为对照,E组抑制率为357.79%,高于D组38.17%;设未输注NK细胞的C组为对照,D组抑制率为126.21%,E组抑制率高过D组15.08%,达141.29%。说明通过人工诱导KIR错配的方法提高单倍体相合KIR的错配率,提升了NK细胞的抗肿瘤效应。本研究的创新点:理论方面,提出通过阻断供者NK细胞KIR（Ly49）的表达,模拟临床的KIR错配,诱导供者NK细胞对受者的杀伤作用,以增强NK细胞抗肿瘤效应,降低白血病移植后复发率。实验方法方面,采用的移植模式为F1（C57B/6×BALB/c）(H-2b/d,Ly49A+Ly49C+)向C57BL/6小鼠（H-2b,Ly49C+）骨髓移植,其中Ly49A+Ly49C+的供者NK细胞,在阻断Ly49C表达后,保留Ly49A的表达,可以识别自身的H-2d,从而在诱导供者NK细胞对受者白血病细胞和骨髓细胞杀伤的同时,保留对自身耐受,以保证供者细胞能顺利植入、实现造血重建。研究价值:本研究为提升NK细胞的抗肿瘤效应找到一个潜在有效靶点,作用于HLA-KIR信号系统,使NK细胞偏向活化的功能状态,并可能将这一思路扩展到其他免疫效应细胞,为建立遗传指导下的过继性细胞免疫治疗方案提供了理论和实验依据。
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相关论文文献
- [1].地西他滨增强allo-NK细胞杀伤白血病干细胞敏感性研究[J]. 中国实验血液学杂志 2017(01)
- [2].白藜芦醇对髓系白血病干细胞增殖和凋亡的影响及其与allo-NK细胞的联合杀伤作用[J]. 中南药学 2014(07)
- [3].Allo-NK细胞对白血病干细胞的免疫作用有哪些?[J]. 家庭生活指南 2020(04)
- [4].小白菊内酯抑制CD34~+CD38~-KG-1a白血病细胞的增殖并增强其被allo-NK细胞杀伤的敏感性[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志 2013(06)
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