圈养野生动物肠球菌耐药分子流行病学研究

论文摘要

目的:调查圈养野生动物的动物源性（动物园、熊猫馆）、环境源性（动物园里的水样、土样）以及人源性（动物园的饲养员、兽医及普通人群）高水平耐氨基糖苷类肠球菌、耐万古霉素肠球菌的耐药性,并对分离出的耐药菌株进行耐药表型、基因型检测及同源性研究,为指导兽医临床合理用药及控制耐药性传播提供理论依据。方法:采用琼脂平板筛选法（ADSP法）筛选高水平庆大霉素肠球菌（HLGRE）、高水平耐链霉素肠球菌（HLSRE）、耐万古霉素肠球菌（VRE）;根据美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的微量肉汤稀释法测定耐药菌株对6种抗菌药物的耐药性;用PCR法对分离出的不同来源的高水平耐氨基糖苷类肠球菌进行菌种的鉴定及耐庆大霉素肠球菌主要耐药基因的检测;采用多重PCR法对不同来源的耐万古霉素肠球菌在进行耐药基因检测的同时进行种水平的鉴定;用重复基因外回文序列-聚合酶链反应（REP-PCR）对筛选出的部分高水平耐庆大霉素肠球、耐万古霉素肠球菌进行基因分型及同源性分析。结果:（1）从动物园（圈养野生动物、水样和土样、饲养员、兽医）、熊猫馆（熊猫）及普通人群共283个样本中筛选出165株HLGRE、39株VIE。从动物园（部分圈养野生动物、饲养员、兽医）、熊猫馆（熊猫）及普通人群共74份样本中筛选出38株HLSRE。不同来源的分离率不同:其中动物源性高水平耐庆大霉素肠球菌、高水平耐链霉素肠球菌的分离率最高,分别占65.92%、64.86%,但普通人群的高水平耐庆大霉素肠球菌、高水平耐链霉素肠球菌检出率仅分别为23.81%、19.05%,而耐万古霉素肠球菌的分离率存在较大的差异,为0%37.5%,且均为中介菌。药敏实验结果显示,不同来源的高水平耐氨基糖苷类肠球菌、耐万古霉素肠球菌均以红霉素和土霉素的耐药率最高,以氨苄西林的耐药率最低。其中高水平耐氨基糖苷类肠球菌中,屎肠球菌的耐药性高于粪肠球菌。（2）PCR法检测高水平耐庆大霉素耐药基因:不同来源的165株高水平耐庆大霉素肠球菌中,aac（6’）-Ie-aph（2〞）-Ia基因的阳性率为88.48%（146/165）。其中在筛选出的高水平耐庆大霉素肠球菌中,圈养野生动物动物源性、环境源性、人源性的aac（6’）-Ie-aph（2〞）-Ia基因阳性率分别为88.98%（105/118）、84.37%（27/32）、93.33%（14/15）。均未扩增出aph（2 "）-Ib;aph（2 "）-Ic;aph（2"）-Id基因。多重PCR法检测耐万古霉素耐药基因:26株动物源性的耐万古霉素肠球菌中,2株VanB型肠球菌,9株VanC1型肠球菌,12株VanC1/C2型肠球菌,未扩增出VanA型肠球菌,3株基因型不明;7株环境源性的耐万古霉素肠球菌中,2株VanB型肠球菌,1株VanC1型肠球菌,3株VanC1/C2型肠球菌,未扩增出VanA型肠球菌,1株基因型不明;6株人源性耐万古霉素肠球菌中,4株VanB型肠球菌,2株VanC1型肠球菌,未扩增出VanA、VanC1/C2型肠球菌。（3） REP-PCR结果显示,不同来源的高水平耐庆大霉素肠球菌、耐万古霉素肠球菌可分为23个型,不同的型又可分为24个亚型。同源性结果分析显示,在不同来源的高水平耐庆大霉素肠球菌中,有6组分别具有100%的同源性,包括分离自熊猫馆的5、8;动物园肉食动物的1、4;动物园爬行两栖类动物的2、4、5;普通人群的7、11;动物园饲养员的5和8,6和7。在不同来源的耐万古霉素肠球菌中,分离自动物园环境的2和3,1、8和9及分离自动物园不同动物的4和7,14和15,1、3和10具有100%同源性。结论:（1）不同来源的肠球菌对氨基糖苷类高水平耐药十分普遍,大多数肠球菌对高浓度庆大霉素耐药由aac（6’）-Ie-aph（2〞）-Ia基因介导,且屎肠球菌的耐药性明显高于粪肠球菌。耐万古霉素肠球菌的检出率较高,但圈养野生动物（动物源性、环境源性）主要由VanC介导,人源性主要由VanB介导,耐药表型与基因型一致。分离的耐药菌对红霉素、土霉素耐药率最高,而对环氨苄西林的耐药率最低。（2）同源性分析显示:圈养野生动物（动物源性、环境源性）的HLGRE、VIE在同种群的动物之间、不同种群的动物之间、不同的环境之间都存在同源性为100%的菌株,且饲养员之间、普通人群之间也存在这种现象。考虑到圈养野生动物的特殊性以及不同人群可能存在直接或间接的接触,说明可能存在不同水平的水平传播或克隆传播。（3）对圈养野生动物（动物源性、环境源性）及人源性（饲养员、兽医、普通人群）高水平耐氨基糖苷类肠球菌、耐万古霉素肠球菌的耐药现状、耐药机制进行研究,可以更合理地指导预防和临床用药,揭示其可能的传播途径,为公共健康奠定基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 引言
• 1 研究背景
• 2 肠球菌简介
• 2.1 肠球菌属的生物学特性和分类
• 2.1.1 肠球菌属的生物学特性
• 2.1.2 肠球菌属的分类
• 2.2 肠球菌的耐药特点
• 2.2.1 固有耐药
• 2.2.2 获得性耐药
• 2.3 肠球菌的耐药机制
• 2.3.1 β-内酰胺类抗生素耐药
• 2.3.2 大环内酯类耐药
• 2.3.3 四环素类耐药
• 2.3.4 氨基糖苷类耐药
• 2.3.5 糖肽类耐药
• 3 高水平耐庆大霉素肠球菌（HLGRE）
• 3.1 HLGRE 国内外流行现状
• 3.2 HLGRE 相关的耐药基因
• 3.2.1 aac（6＇）-Ie-aph（2＂）-Ia
• 3.2.2 aph（2＂）-Ib
• 3.2.3 aph（2＂）-Id
• 3.2.4 aph（2＂）-Ic、aph（2＂）-Ie
• 4 耐万古霉素肠球菌（VRE）
• 4.1 VRE 国内外流行现状
• 4.2. VRE 相关的耐药基因
• 4.2.1 VanA 型
• 4.2.2 VanB 型
• 4.2.3 VanC 型
• 4.2.4 VanD、VanE、VanG 型
• 5 肠球菌耐药性的传播
• 6 研究内容
• 7 本项目研究意义
• 第一章 高水平耐氨基糖苷类肠球菌、耐万古霉素肠球菌的分离及耐药表型的测定
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 样本来源
• 1.1.2 药品与试剂
• 1.1.3 标准菌株
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 圈养野生动物的基本特点及用药背景的调查
• 1.2.2 HLGRE、HLSRE 及VRE 的表型筛选
• 1.2.3 菌株的鉴定与保存
• 1.2.4 菌株对6 种抗生素的体外敏感性测定试验
• 1.2.5 统计学处理
• 2 结果
• 2.1 不同来源的高水平耐氨基糖苷类肠球菌、耐万古霉素肠球菌的分离结果
• 2.1.1 HLGRE 的分离结果
• 2.1.2 HLSRE 的分离结果
• 2.1.3 VRE 的分离结果
• 2.2 不同来源HLGRE、HLSRE|、VRE 的鉴定结果
• 2.2.1 不同来源HLGRE 的鉴定结果
• 2.2.2 不同来源HLSRE 的鉴定结果
• 2.2.3 不同来源VRE 的鉴定结果
• 2.3 不同来源HLGRE、HLSRE、VRE 对6 种抗生素的药敏试验结果
• 2.3.1 HLGRE 对6 种抗生素的药敏试验结果
• 2.3.2 HLSRE 对6 种抗生素的药敏试验结果
• 2.3.3 VRE 对6 种抗生素的药敏试验结果
• 3 讨论
• 第二章 HLGRE、VIE 耐药基因的检测
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株来源
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 模板的制备
• 1.2.2 PCR 法扩增耐药基因
• 1.2.2 多重PCR 法扩增耐万古霉素肠球菌耐药基因
• 2 结果
• 2.1 HLGRE 耐药基因的检测结果
• 2.2 VIE 耐药基因的检测结果
• 2.3 不同来源HLGRE 的aac（6'）-Ie-aph（2〞）-Ia 耐药基因的检测结果比较
• 2.4 不同来源VIE 的耐药基因的检测结果比较
• 3 讨论
• 第三章 不同来源HLGRE、VIE 同源性研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株来源
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 REP-PCR 引物的设计
• 1.2 方法
• 1.2.1 细菌基因组DNA 的提取
• 1.2.2 PCR 扩增
• 1.2.3 结果判定
• 2 结果
• 2.1 38 株不同来源HLGRE 的基因分型及同源性分析
• 2.1.1 REP-PCR 指纹图谱
• 2.1.2 REP-PCR 电泳图谱聚类分析
• 2.2 28 株不同来源的VIE 同源性比较
• 2.2.1 REP-PCR 指纹图谱
• 2.2.2 REP-PCR 电泳图谱聚类分析
• 3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢