金雀异黄素协同TRAIL诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡及其作用机制的研究

论文摘要

目的:流行病学调查显示,乳腺癌是欧洲及北美地区妇女最常罹患的肿瘤;而在亚洲,特别是中国和印度,乳腺癌的发病率也呈逐年上升的趋势,因此寻找有效的治疗方法,仍然是众多学者们关注的热点。新近研发的肿瘤坏死因子凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）是化疗药物肿瘤坏死因子家族新成员,具有选择性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞没有毒性的生物学特点。但最近研究表明,超过50%的肿瘤细胞对其产生耐药,其中包括乳腺癌MCF-7细胞,产生耐药的机制之一是细胞对药物诱导的凋亡产生抵抗。而大豆异黄酮（soybean isoflavones,SI）具有显著的防癌抗癌效果,其抗肿瘤作用又与其诱导肿瘤细胞凋亡等活性有关。因此,本文以乳腺癌MCF-7细胞为研究对象,初步探讨大豆异黄酮的主要成分金雀异黄素（Genistein,Gen）是否能够协同TRAIL诱导MCF-7细胞发生凋亡,从而达到逆转耐药的作用,并探讨其可能的内在机制,寻找有效克服细胞凋亡抵抗的措施,为临床合理用药提供一定的指导,为乳腺癌的治疗探寻新的途径。方法:体外培养 MCF-7 细胞,分别以 1.25,2.5,5,10,20,40μg/mlGen 及 1,10,100,1 000ng/ml TRAIL单独干预48h后,应用MTT法检测MCF-7细胞增殖情况。随后根据其结果,将两药联合处理细胞,并计算两药相互作用系数（coefficient of drug interaction,CDI）,最终选择浓度为 20μg/ml Gen 及 100ng/ml TRAIL作为后续试验的浓度。将MCF-7细胞分为4组,即对照组、Gen组（终浓度为20μg/ml）、TRAIL组（终浓度为100ng/ml）及Gen+TRAIL组。细胞经不同方式处理48小时后,倒置显微镜下观察细胞形态学改变;应用流式细胞仪检测细胞凋亡率及线粒体跨膜电位改变情况;免疫荧光法检测细胞凋亡中caspase-3,caspase-8,caspase-9酶活性;应用酶联免疫吸附方法检测细胞NF-κB含量以及western blotting检测Bcl-2和Bax蛋白变化。结果:1.MTT法检测乳腺癌细胞增殖情况:乳腺癌细胞分别经Gen和TRAIL单独处理后结果显示,各浓度Gen之间及其与对照组比较,差异均有统计学意义（P<0.0l）,在2.5-40μg/ml范围内Gen的浓度与细胞的抑制率存在正相关关系（r=0.919,P<0.05）,且 Gen 的 IC50 为 20μg/ml;而单独使用 TRAIL时,当浓度达到100ng/ml及以上才显示出抑制细胞增殖的作用（P>0.05）,并且浓度与抑制率不存在线性相关关系（r=0.784,P>0.05）。经MTT法检测细胞增殖抑制试验及CDI评定方法确定的两药联合浓度为Gen 20μg/ml及TRAIL 100ng/ml,两者联合作用于乳腺癌细胞48小时后,Gen明显增强TRAIL对MCF-7细胞增殖的抑制作用（抑制率为63.78±2.61%）,与单用药物组和对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。2.倒置显微镜下观察MCF-7细胞形态学改变:对照组细胞贴壁生长状态良好,且细胞形态正常;单独使用TRAIL组中大多数细胞贴壁良好且形态正常,少数胞质中出现空泡,且细胞数量略有减少;单独使用Gen中,贴壁细胞明显减少且细胞皱缩,培养液中漂浮大量细胞及细胞碎片;联合用药组仅少数细胞细胞贴壁且大多数已失去正常形状,胞质内充满大量气泡,培养液中漂浮大量细胞。3.流式细胞术检测细胞凋亡率显示,Gen能够促进TRAIL诱导细胞凋亡的发生（凋亡率为42.20±1.35%）,高于TRAIL单独处理组（凋亡率为12.61 ± 1.53%）（P<0.01）。4.检测MCF-7细胞线粒体跨膜电位检测表明,经TRAIL单独处理的MCF-7细胞线粒体跨膜电位中位数为826.38±7.47,而在联合应用Gen以后,MCF-7细胞线粒体跨膜电位中位数显著降低到68.35±13.73,与单独用药组比较差别有统计学意义（P<0.01）。5.免疫荧光法检测结果显示,单独使用TRAIL时caspase-3,caspase-8及caspase-9 活性较低,分别为 17.32±0.88,10.14±0.20 和 9.26±0.04μmol/L/hr/mg protein,当联合应用 Gen 后,caspase-3,caspase-8 及 caspase-9活性均分别增高至 44.00±0.45,13.76±0.38 和 24.64±0.15μmol/L/hr/mg protein,与单独用药组比较差别均具有统计学意义（P<0.01）。6.ELISA方法检测单独应用TRAIL处理细胞时,NF-κB的含量为343.333±8.064pg/ml,在与Gen联用后,Gen能够明显增强TRAIL抑制NF-κB的合成能力,NF-κB的含量降低至177.453±25.389pg/ml,差别有统计学意义（P<0.01）。7.western blotting结果表明,单独应用TRAIL时,Bcl-2、Bax蛋白相对表达量及 Bax/Bcl-2 比值分别为 0.90±0.06,0.96±0.08 及 1.06±0.09,当与 Gen联合应用后,Bcl-2蛋白的合成受到抑制（0.63±0.06）,Bax蛋白合成增加（1.18±0.03）,Bax/Bcl-2比值升高（1.88±0.23）,与相应单独用药组比较差异具有统计学意义（P<0.01）。结论:当Gen的浓度高于2.5μg/ml时可抑制MCF-7细胞生长,即随着Gen浓度的增加,其对细胞增殖的抑制作用亦增强,存在剂量依赖关系。另外,虽然TRAIL浓度高于100ng/ml时,可抑制乳腺癌细胞的生长,但是并没有出现剂量依赖关系,而出现了平台期,说明MCF-7细胞对TRAIL不敏感。20μg/ml Gen分别与1,10,100,1OOOng/ml TRAIL联用时都具有协同抑制MCF-7细胞生长的效应,其中20μg/ml Gen与100ng/ml TRAIL联用组MCF-7细胞的抑制率最高,CDI指数最低,说明此联合用药浓度组协同抑制细胞增殖的能力最强。20μg/mlGen与100ng/ml联合作用于MCF-7细胞48小时后,Gen协同TRAIL诱导乳腺癌MCF-7细胞发生凋亡、增加乳腺癌细胞对TRAIL的敏感性,其可能的机制是Gen放大了 TRAIL诱导细胞凋亡的线粒体途径效应,并协同TRAIL激活了细胞凋亡过程中caspase-3,caspase-8及caspase-9,同时抑制NF-κB及Bcl-2抗凋亡蛋白的合成,调控促凋亡蛋白Bax的合成增加,从而最终协同诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡的发生。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、Gen、TRAIL对人乳腺癌MCF-7细胞生长抑制及凋亡影响的实验研究
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 MTT法测定细胞生长曲线情况
• 1.2.2 单独及联合使用Gen和TRAIL对细胞生长的抑制作用
• 1.2.3 倒置相差显微镜观察细胞形态学改变情况
• 1.2.4 Gen、TRAIL单独及联合应用诱导细胞凋亡的研究结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、Gen协同TRAIL诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡机制的实验研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• m）'>2.2.1 流式细胞仪检测细胞线粒体跨膜电位（△Ψ_m）
• 2.2.2 细胞半胱天冬酶-3,8,9（caspase-3,8,9）活性检测
• 2.2.3 酶联免疫吸附方法（ELISA）检测细胞核转录因子（NF-κB）活性
• 2.2.4 western blotting检测细胞Bax、Bcl-2蛋白
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 综述参考文献
• 致谢