中国对虾氧位—甲基转移酶基因克隆、表达分析与功能研究 ——附：泥鳅CD59基因克隆、表达分析与重组表达研究

论文摘要

病害一直是困扰水产养殖业的最大问题，研究水产养殖品种的抗病相关基因，利用其本身的抗病因子加强抗病力，发展新的免疫防治对策，取代或减少药物使用是水产养殖品种病害防治的根本。本论文从细菌刺激的中国对虾中克隆了一个氧位-甲基转移酶基因，从细菌刺激的泥鳅中克隆了一个CD59基因，并对这两个基因进行了表达模式和功能研究，结果如下： 一、首次克隆了中国对虾COMT基因 儿茶酚-氧位-甲基转移酶（Catechol-O-methyltransferase，简称COMT,E.C.2.1.1.6）是一种氧位-甲基转移酶。尽管氧位-甲基转移酶转甲基的化学机制都是一样的，但由于甲基受体分子的不同，氧位-甲基转移酶的种类也有所不同。动物有两种氧位-甲基转移酶被广为研究：一种是法呢酸-氧位-甲基转移酶（famesoic acid-O-methyltransferase，简称FAMeT）：另一种就是COMT。通过对甲壳动物FAMeT的研究得知，FAMeT是催化法呢酸甲基化反应生成法呢酸甲酯的氧位-甲基转移酶，对甲壳动物的生长、卵巢发育和蜕皮具有调控作用。COMT可以催化S腺苷蛋氨酸的一个甲基转移到含儿茶酚结构的底物分子上，形成甲基化的产物，所以，COMT可以灭活儿茶酚胺类以及其它的儿茶酚型化合物，当然，也包括含有儿茶酚结构的有毒物质和临床药物。 自从1958年人的COMT被首次发现以来，COMT在脊椎动物和无脊椎动物中都有发现，然而，关于甲壳类COMT的研究还未见报道。 本文利用抑制性消减杂交技术（SSH）和SMART cDNA方法，克隆了中国对虾COMT基因，该基因全长cDNA序列已提交给GenBank，登录号为DQ091255。中国对虾COMT基因全长917bp，含有一个完整的开放阅读框，编码的成熟肽由221个氨基酸组成，其理论分子量是24572.06 Da，等电点是5.27，推测该成熟肽有10个磷酸化的氨基酸位点，不具信号肽，说明中国对虾COMT不分泌到循环的血液中，而是依赖特定氨基酸的磷酸化起调控作用。另外，推测中国对虾COMT中第18-221个氨基酸残基构成了一个保守区，该保守区属于甲基转移酶-3家族。 甲基转移酶-3家族成员很多，包括COMT、细菌氧位-甲基转移酶（简写为OMT）和咖啡酰辅酶A-氧位-甲基转移酶（简写为CCoAOMT）。通过氨基酸序列比对发现，本文克隆的中国对虾COMT基因与人和其它的哺乳动物的COMTs具有较高的的同源性，而与甲壳动物十足目的FAMeTs没有重要的序列相似性。系统发育分析也将本文克隆的中国对虾COMT基因与其它物种的COMTs归为同一类群，而与甲壳动物的FAMeTs分属不同类群，依此推论中国对虾氧位-甲基转移酶基因不属于FAMeTs，而

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 综述：氧位-甲基转移酶研究进展
• 1.氧位-甲基转移酶概述
• 1.1 氧位-甲基转移酶的性质
• 1.2 微生物氧位-甲基转移酶
• 1.3 植物氧位-甲基转移酶
• 1.4 动物氧位-甲基转移酶
• 2.儿茶酚-氧位-甲基转移酶研究进展
• 2.1 COMT的分子特征
• 2.2 COMT的酶活性特点
• 3.中国对虾COMT的研究意义
• 参考文献
• 第二章 中国对虾氧位-甲基转移酶基因克隆与表达分析
• 1.材料
• 1.1 实验动物、组织和血淋巴
• 1.2 菌株和载体
• 1.3 试剂
• 1.4 仪器
• 2.方法
• 2.1 中国对虾血细胞cDNA消减文库构建
• 2.2 中国对虾氧位-甲基转移酶基因3’端克隆
• 2.3 中国对虾氧位-甲基转移酶基因5’端克隆
• 2.4 中国对虾氧位-甲基转移酶基因序列分析与系统发育分析
• 2.5 中国对虾氧位-甲基转移酶基因Northern blot
• 2.6 中国对虾氧位-甲基转移酶基因原位杂交（In situ hybridisation,ISH）
• 3.实验结果
• 3.1 中国对虾氧位-甲基转移酶基因克隆
• 3.2 中国对虾氧位-甲基转移酶基因序列分析
• 3.3 中国对虾氧位-甲基转移酶基因序列比对与系统发育分析
• 3.4 中国对虾氧位-甲基转移酶基因Northern blot
• 3.5 中国对虾氧位-甲基转移酶基因原位杂交
• 4 讨论
• 4.1 中国对虾OMT基因与甲壳动物OMT基因序列比较
• 4.2 中国对虾OMT
• 参考文献
• 第三章 中国对虾儿茶酚-氧位-甲基转移酶原核表达与功能分析
• 1.材料
• 1.1 载体、菌株和引物
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 色谱系统
• 2.方法
• 2.1 表达质粒Comt／pET-30a（+）构建
• 2.2 重组蛋白表达
• 2.3 重组蛋白纯化
• 2.4 重组蛋白COMT活性检测
• 3.实验结果
• 3.1 表达质粒Comt／pET-30a（+）构建
• 3.2 重组蛋白表达和纯化
• 3.3 重组蛋白COMT活性检测
• 参考文献
• 附：第一章 综述：鱼类免疫研究进展
• 1.鱼类获得性免疫
• 2.鱼类先天性免疫
• 2.1 鱼类先天免疫的非自身识别
• 2.2 鱼类先天免疫的防御体系
• 3.鱼类的补体免疫系统
• 3.1 补体激活途径
• 3.2 补体调控蛋白
• 参考文献
• 附：第二章 泥鳅CD59基因克隆、表达分析与重组表达研究
• 1.材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 2.实验方法
• 2.1 泥鳅CD59基因cDNA克隆
• 2.2 泥鳅CD59基因内含子扩增
• 2.3 泥鳅CD59基因Northern blot
• 2.4 RT-PCR扩增
• 2.5 泥鳅CD59基因原位杂交
• 2.6 泥鳅CD59基因原核表达
• 3.结果
• 3.1 泥鳅CD59基因克隆
• 3.2 泥鳅CD59基因序列比对与系统发育分析
• 3.3 泥鳅CD59基因Northern blot
• 3.4 RT-PCR
• 3.5 泥鳅CD59基因原位杂交
• 3.6 泥鳅CD59基因原核表达
• 参考文献
• 总结
• 致谢
• 攻读博士学位期间已发表和整理中的学术论文
• 学位论文评阅及答辩情况表