脂联素（gAdiponectin）的大量制备及其调控成骨细胞分化的功能研究

论文摘要

脂肪组织是人体最大的能量储存库。在机体需要能量时,脂肪组织动用储存的脂肪,向机体供能。近来的研究发现脂肪组织也是一个极其重要的内分泌器官。Adiponectin就是由脂肪组织分泌的一种活性多肽,又名GBP28（gelatin bindingprotein 28）、adipoQ、apM1（Adipose most gene transcript 1）、Acrp30（adipocytecomplement related protein 30kD）等。Adiponectin参与能量代谢、炎症反应等生理过程,与肥胖（obesity）、2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）、动脉粥样硬化（atherosclerosis）、心血管疾病（cardiovascular disease/CVD）等疾病有密切的关系。Adiponectin由247个氨基酸组成,分子量为30kDa。全长Adiponectin由四个部分组成,包含氨基端的信号序列、可变区、胶原样区和羧基端的球状结构域。血浆中Adiponectin的存在形式包括同源三聚体、六聚体和更多亚单位组成的更大的复合体形式,以及由蛋白酶酶切产生的球状结构域单体形式。Adiponectin球状结构域（globular domain of Adiponectin,gAdiponectin）是其活性结构域,是其发挥生物学功能的结构基础。动物实验证明Adiponectin可以降低血循环中FFA和TG的水平;降低血糖和改善机体的胰岛素抵抗状态,而且长期小剂量的注射重组的Adiponectin可以在不影响食欲的情况下降低体重。研究发现gAdiponectin比全长Adiponectin具有更强的生物学活性。所以将gAdiponectin开发成具有降低血糖、血脂和减肥多重功能的一类新药是非常有意义的。目前并没有一种能够高效制备gAdiponectin的方法,国外也因为gAdiponectin的制备不能满足实验需要而退出三期临床实验。为了能够简单、快速、经济地大量制备有天然生物学活性的gAdiponectin,我们选择巴氏毕赤酵母（Pichia.pastoris）作为表达系统。巴氏毕赤酵母（Pichia.pastoris）是近年来发展起来的一个十分有效的外源蛋白表达系统,广泛用于外源蛋白的体外表达。但是有一些外源蛋白使用的部分密码子不能被巴氏毕赤酵母蛋白翻译系统有效识别和翻译,而需要将部分非毕赤酵母偏爱的密码子突变成毕赤酵母偏爱的密码子,外源蛋白才能在毕赤酵母表达系统中得到有效的表达。我们将gAdiponectin cDNA中部分非毕赤酵母偏爱密码子同义突变为毕赤酵母偏爱的密码子,然后将突变的gAdiponectin cDNA克隆到pPIC9K表达质粒中,转化至毕赤酵母表达系统,实现了gAdiponectin的分泌表达,获得了高效表达人gAdiponectin的多拷贝转化子作为工程种子菌。为了大量地制备gAdiponectin,我们利用30L发酵罐进行高密度发酵,工程菌生长18小时,菌密度OD600达到150左右时,甲醇诱导培养30小时,菌密度可达到350。目的蛋白表达水平超过100mg/L。发酵上清超滤浓缩、脱盐后,经离子交换、凝胶过滤两步纯化,可以得到纯度大于95%的rh-gAdiponectin。我们利用巴氏毕赤酵母系统表达人gAdiponectin,工艺流程操作简单、周期短、成本低,目的蛋白以可溶的活性形式分泌到培养基中。和已报道的gAdiponectin制备方法相比,既避免了目的蛋白的复性过程,也缩短了生产周期,降低了成本,提高了产率。动物实验证明rh-gAdiponectin具有明显的降血糖、降血脂的功能。这就为将rh-gAdiponectin开发成适用于临床的药物奠定了基础。Adiponectin（脂联素）作为一个具有广泛生物学功能的脂肪细胞因子,对于体内多种器官和细胞都有其特有的作用。那么除了已有的关于脂联素的多种生物学功能的报道之外,脂联素还有没有其他的功能呢?有研究表明,肥胖患者骨质疏松的发病率较低。提示能量代谢和骨代谢可能受到同类因子的调控。已经有报道显示脂肪细胞因子是调控骨代谢的一类重要的细胞因子。Leptin（瘦素）是第一个被报道的具有抑制骨形成的脂肪细胞因子。同时临床流行病学研究发现,Adiponectin（脂联素）的循环水平也和骨质疏松的发病呈一定的负相关,说明Adiponectin可能具有负性调控骨形成的功能。目前有一些报道显示,全长的Adiponectin可以刺激成骨细胞增殖和分化,也有报道显示其抑制骨形成,所以Adiponectin对成骨细胞分化和骨形成到底具有什么功能,目前还没有定论。我们建立了成骨细胞分化模型,研究重组人gAdiponectin其对成骨细胞分化的作用。在体内,成骨细胞是由间充质干细胞分化而来的。在成骨细胞分化过程中,有两个十分关键的转录因子:Runx2和Osterix。它们调控成骨细胞特异蛋白（如:碱性磷酸酶,骨钙素,胶原等）的表达、细胞外基质的钙化和成骨细胞的分化、成熟。我们首先在体外成功建立了MC3T3-E1前成骨细胞分化模型。在细胞诱导过程中,加入不同剂量的gAdiponectin,结果显示gAdiponectin可以显著下调成骨细胞特异的功能蛋白（如碱性磷酸酶,骨钙素）的表达水平,显著延迟细胞外基质的钙化和矿化结节的形成,明显抑制成骨细胞的分化和细胞外基质矿化成熟。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 人gAdiponectin的大量制备
• 引言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 gAdiponectin对成骨细胞分化的抑制作用
• 引言
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 发表论文
• 发表综述
• 申请专利
• 在校获奖情况
• 致谢