西伯利亚蓼抗病基因克隆、双价载体构建及遗传转化

论文摘要

根据西伯利亚蓼抑制消减文库（SSH）中获得的硫堇基因（THI）、几丁质酶基因（CHI）和葡聚糖酶基因（GLUC）的部分序列,应用RACE技术同时克隆了THI、CHI和GLUC基因全长的cDNA序列,生物信息学分析表明,西伯利亚蓼THI（PsTHI1）与鼠尾草（Salvia miltiorrhiza）等植物THI有较高的同源性,具保守的植物THI标签,此成熟THI带正电荷,偏碱性,推定可能具有抗病原微生物活性,为一种新的植物THI;西伯利亚蓼CHI（PsCHI1）具保守的植物几丁质酶（CHI）家族19标签1序列特征,与植物classⅣCHI前体序列具有高度的同源性,推测为植物classⅣCHI,分泌到细胞外,无跨膜区,根据其它植物CHI的结构域,确定PsCHI1具有能够水解真菌细胞壁的结构,推测其可能有抗真菌病的功能;西伯利亚蓼GLUC（PsGLUC1）所编码的蛋白（PsGLUC1）呈酸性,带负电荷,该编码蛋白与水稻（Oryza sativa L.japonica）内切型1,3;1,4-β-D-葡聚糖酶（endo-1,3;1,4-beta-D-glucanase）有较高的同源性,故初步推断PsGLUC1属于葡聚糖酶家族。采用实时荧光定量PCR技术,研究了PsGLUC1和PsCHI1基因在西伯利亚蓼不同组织、不同时间的盐碱胁迫及去胁迫过程中表达特性。结果表明,PsCHI1基因表达具明显的组织特异性,无论在非胁迫、NaHCO3胁迫还是去胁迫过程叶部的表达量明显高于茎部的表达量。PsGLUC1基因表达不具明显的组织特异性,在茎和叶中均有表达。在盐碱胁迫条件下,两个基因在茎和叶中均具有不同的表达模式。另外,无论在茎还是叶部,PsCHI1基因与PsGLUC1基因均受盐碱胁迫的影响。以已构建的PsCHI1/pROKⅡ和PsGLUC1/pROKⅡ两个单价载体为基础,采用“中间载体pGEM-T easy更换酶切位点法”和“35S和Tnos引物PCR方法”,均成功构建35S-PsGLUC1-Tnos-35S-PsCHI1-Tnos/pROKⅡ植物双价表达载体。通过对两种方法的分析比较,结果表明“35S和Tnos引物PCR方法”能够快速高效构建具完整表达框的pROKⅡ植物双价表达载体。应用此法去除了中间载体更换酶切位点的繁琐过程,减少了连接、转化的次数,明显地提高了工作效率。构建了EHA105（PsCHI1/pROKⅡ）、EHA105（PsGLUC1/pROKⅡ）两个单价农杆菌工程菌株和EHA105（PsCHI1-PsGLUC1/pROKⅡ）一个植物双价农杆菌工程菌株。并应用此双价农杆菌工程菌株成功将均具完整表达框的35S-PsGLUC1-Tnos-35S-PsCHI1-Tnos双价基因同时导入烟草基因组中,获得卡那抗性植株17株,对6个转化株系进行PCR检测,结果全部为阳性。RT-PCR分析表明,转入的外源PsGLUC1基因和PsCHI1基因能够在转录水平上表达。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 绪论
• 1.1 目的意义
• 1.2 植物抗病基因的克隆
• 1.2.1 植物抗病基因的克隆技术
• 1.2.2 抗病基因克隆的快捷策略
• 1.3 植物抗真菌病害基因工程的策略
• 1.3.1 导入植物防卫反应基因增强植物抗病性
• 1.3.2 导入降解或抑制病原菌致病因子的基因使植物抗病
• 1.4 硫堇蛋白的研究与应用
• 1.4.1 硫堇蛋白
• 1.4.2 硫堇蛋白的分类及一级结构特征
• 1.4.3 硫堇蛋白的功能、作用机理及应用
• 1.5 植物几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的研究及其应用
• 1.5.1 植物几丁质酶的研究进展
• 1.5.2 植物几丁质酶的结构特征及分类
• 1.5.3 几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的特性、作用机理及应用
• 1.6 多基因转化策略
• 1.7 关于西伯利亚蓼的研究
• 2 西伯利亚蓼抗病基因的克隆、序列分析及表达特性研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 分子生物学及生化试剂
• 2.1.4 寡聚核苷酸引物
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 RNA提取缓冲液的配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 植物材料西伯利亚蓼的处理
• 2.2.2 从SSH中分析筛选抗病相关基因EST
• 2.2.3 西伯利亚蓼总RNA的提取
• 2.2.4 5'RACE及3'RACE模板的cDNA合成
• 2.2.5 西伯利亚蓼硫堇基因的克隆和序列分析
• 2.2.6 西伯利亚蓼几丁质酶基因的克隆、序列分析
• 2.2.7 盐胁迫下西伯利亚蓼葡聚糖酶基因的克隆、序列分析
• 2.2.8 盐胁迫下PsCHI1和PsGLUC1基因在西伯利亚蓼中的表达特性研究
• 2.2.9 结果与分析
• 2.2.10 讨论
• 2.2.11 本章小结
• 3 快速构建pROKⅡ植物双价表达载体的方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株与质粒
• 3.1.3 分子生物学及生化试剂
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 大肠杆菌质粒DNA的提取
• 3.2.2 PsCHI1/pROKⅡ和PsGLUC1/pROKⅡ单价表达载体的构建
• 3.2.3 PsCHI1-PsGLUC1/pROKⅡ双价载体构建策略
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 PsCHI1/pROKⅡ和PsGLUC1/pROKⅡ单价载体质粒的酶切验证
• 3.3.2 "中间载体"更换酶切位点法构建双价载体的产物鉴定
• 3.3.3 35S和Tnos引物PCR方法构建双价载体的产物鉴定
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 4 双价表达载体在烟草中的遗传转化分析
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 菌株与质粒
• 4.1.3 酶及生化试剂
• 4.1.4 储备液的制备
• 4.1.5 仪器设备
• 4.1.6 烟草组织培养所需培养基
• 4.1.7 DNA提取缓冲液的配制
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 单价载体及双价表达载体转化农杆菌
• 4.2.2 双价基因烟草的遗传转化
• 4.2.3 转基因烟草植株的分子鉴定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 农杆菌重组质粒的PCR鉴定
• 4.3.2 烟草的遗传转化
• 4.3.3 转基因烟草植株的分子鉴定
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录1 构建两个单价载体流程
• 附录2 "中间载体更换酶切位点法"构建双价载体流程
• 附录3 "35S和Tnos引物PCR法"构建双价载体流程
• 附录4 几种植物表达载体35S启动子序列比对
• 附录5 几种植物表达载体Tnos序列比对
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢