论文摘要
实现高产是玉米育种的主要目标之一,是解决粮食问题的的根本途径。籽粒灌浆是决定玉米产量的一个关键因素。玉米Incw2基因是该过程的关键调控因子。在灌浆前期,该基因编码一种碳源分配所需的细胞壁转化酶INCW2,调控蔗糖卸载,促进籽粒灌浆,进而形成籽粒产量。研究发现,Incw2基因为组织特异性基因,于灌浆期在玉米胚乳中特异表达。本研究利用同源克隆的方法,克隆了水稻谷蛋白基因启动子pGt1（水稻胚乳特异性启动子）和口的基因玉米细胞壁转化酶基因Incw2,构建了由pGtl驱动目的基因的植物表达载体3300-Gtl-Incw2-bar.同时,以带有玉米醇溶蛋白基因p27kD（玉米胚乳特异性启动子）的表达载体3300-27kD-nos-bar作为基础载体,构建了山p27kD启动子驱动目的基因的植物表达载体3300-27kD-Incw2-bar,通过农杆菌介导法将以上两个表达载体分别导入了玉米胚性愈伤组织和茎尖分生组织,以期实现细胞壁转化酶在玉米胚乳中的过量表达,达到促进籽粒灌浆,提高籽粒产量的效果。本研究目前已取得如下结果：1.胚乳特异性启动子的获得以水稻基因组DNA为模板,通过同源克隆获得水稻谷蛋白基因Gtl的启动子序列pGtl。测序结果表明,该启动子大小为933bp,与GenBank公布的序列比对具有100%的同源性。2.目的基因的获得以玉米自交系“18-599R”基因组DNA为模板,克隆了玉米细胞壁转化酶Incw2基因序列。测序结果表明,所克隆的序列全长为2957bp,包括7个外显子,编码594个氨基酸。Blast结果显示,该基因CDS序列与GenBank中报道序列的同源性为99%。3.表达载体的构建分别构建了山pGt1和p27kD胚乳特异性启动子驱动Incw2基因的植物表达载体3300-Gtl-Incw2-bar、3300-27kD-Incw2-bar.表达载体的的序列分析结果表明,表达载体构建过程中目的基因不存在任何突变。4.转化系统的建立利用玉米自交系“18-599R”的愈伤组织转化系统实现了山农杆菌介导的以上2个表达载体的遗传转化,并成功建立了由农杆菌介导的18-588W,R08自交系的茎尖分生组织转化系统。5.抗性转基因植株的获得经除草剂Basta筛选后获得转基因抗性植株。其中通过愈伤组织遗传转化系统分别获得转3300-Gtl-Incw2-bar和转3300-27KD-Incw2-bar的T0代抗性植株38株和13株；通过茎尖分生组织转化系统分别获得了转3300-Gtl-Incw2-bar和3300-27KD-Incw2-bar的T0抗性植株147株和58株。6.阳性转基因植株的获得结合上游启动子和下游目的基因的序列设计特异引物对T0代转基因植株进行PCR检测,分别获得了转3300-Gtl-Incw2-bar和3300-27KD-Incw2-bar的阳性植株34和13株。对T1代转基因株系的PCR分析结果表明,外源基因Incw2在转基因后代中稳定遗传,没有发生基因丢失现象。7.目的基因的有效表达随机选择5个转3300-Gtl-Incw2-bar的T1代转基因株系籽粒进行半定量RT-PCR检测。结果表明,其中4个株系中Incw2的表达量与对照相比有明显提高,且株系间存在差异。测定以上转基因株系细胞壁转化酶活性发现,与半定量RT-PCR结果基本一致,与对照相比,上述4个株系的细胞壁转化酶活性均有显著提高,最高幅度达69.08%，表明Incw2基因已整合到玉米基因组中并进行了有效表达。8.T1代转基因株系产量相关性状有所改善对T1代转基因株系的产量相关性状进行调查,结果表明,各转基因株系授粉后12 d功能叶的光合效率、叶r绿素含量、叶氮含量等均明显高于对照；收获时绿叶数也较对照有不同程度的提高,而株高、穗位高未能发生明显变化。对百粒重进行测定发现,百粒重有所增加,且各株系间存在差异。说明Incw2基因能够促进籽粒灌浆,从而增加产量潜力。
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标签：细胞壁转化酶论文; 胚乳特异性启动子论文; 农杆菌介导论文; 玉米论文; 受体系统论文;