论文摘要
癫痫是一种神经系统疾病，通常是指大脑神经元突然异常放电，导致各种临床表现反复发作的慢性疾病。难治性癫痫也称顽固性癫痫，一般情况下，每月发病超过1次，正确用药超过3种，正规治疗时间超过2年仍无疗效者，可视为难治性癫痫[1]。大约30%的癫痫患者属于难治性癫痫[2]。我国癫痫患病率约为5‰，其中难治性癫痫患者有上百万名，给家庭和社会带来了沉重的经济负担和精神负担。几十年来，利用体外及体内癫痫发作模型努力探讨自发性癫痫反复发作（癫痫病患者的大脑的决定性标志）的分子和细胞机制。尽管我们在理解癫痫发生中获得巨大的进步，但是调查人员仍然没有制定可靠致痫病灶的生物标志物或替代标志物。目前对于导致癫痫发生的病理机制知之甚少，尤其是累积事件比如头部外伤，炎症，或长期热性惊厥所触发的癫痫[3]。癫痫治疗面临的主要挑战是癫痫固有的复杂性和异质性以及癫痫发作表现出的不同的遗传易感性。因此，癫痫发作共享一个基本病理生理机制是不可能的。过去几十年来，抗癫痫治疗的总目标是影响或者阻止原发性癫痫发作的急性过[4-6]。目前癫痫治疗一方面是急需要针对疾病发展变化的治疗，全面或部分阻止癫痫发作的反复发作。癫痫治疗的另一方面是减少或阻止癫痫发作所致的并发症。比如认知障碍，心理障碍所造成的危害。迄今为止，在动物模型中验证的癫痫发病过程中的分子和细胞改变包括：神经元损伤和细胞死亡，轴突和树突的可塑性，突触前和突触后的修饰，神经发生，神经炎症，胶质细胞活化，血管损伤和血管生成，细胞外基质破裂，离子通道结构和功能的改变[7]。近年来，研究发现癫痫发生和能量代谢失衡关系密切，能量代谢物质不平衡可以诱发癫痫发生。比如谷氨酸是中枢神经系统最主要的兴奋性神经递质，广泛分布于中枢神经系统，多种致痫机制通过谷氨酸递质及其受体途径导致癫痫发生。相关文献报道乳酸及乳酸转运体在动物模型的癫痫发生中起到重要作用，转运体的活动不仅直接反映突触信息的传递，当转运体的重摄取功能异常，就可以导致神经递质在突触间隙的浓度变化，从而引起病理生理改变，如果突触前递质质量异常，不仅突触后的受体出现数量改变，而且突触前的转运体也会发生代偿性变化，这种转运体的改变要比受体的改变更敏感、更直接。近年来一些研究发现转运体对癫痫的发生和抗癫痫药的作用机理、新药开发都出现了新的看法。基于此，我们进行以下研究：第一部分MCT4在癫痫动物模型和临床癫痫样本表达分析目的：研究MCT4在癫痫动物模型和临床癫痫样本表达情况。方法：从第四军医大学唐都医院神经外科标本库中随机选取30例颞叶癫痫组织标本作为实验组，12例外伤组织标本作为对照组。将大鼠分为生理盐水对照组、SE4h、SE12h、SE1d、 SE3d、SE7d、SE14d、SE28d、SE60d组，每组8只。建立大鼠氯化锂-匹罗卡品模型，在模型建立成功后在不同时间点收集大鼠颞叶及海马组织。利用西式印迹检测MCT4在癫痫大鼠皮层及海马组织表达，利用西式印迹和免疫组织化学检测MCT4在癫痫样本中表达情况，同时对临床癫痫样本进行甲基化PCR分析。结果：在西式印迹实验中，MCT4在癫痫模型颞叶皮层中急性期开始表达降低，在潜伏期表达达到最低水平，MCT4在海马的表达和颞叶皮层基本一致。在临床癫痫样本中MCT4表达降低。利用甲基化PCR方法证实MCT4在癫痫样本中表达减少与MCT4启动子区过渡甲基化有关。结论：无论是在癫痫模型还是临床癫痫样本中，MCT4表达均降低，研究还发现MCT4在癫痫样本中表达减少与MCT4启动子区过渡甲基化有关，这提示MCT4可能与癫痫发病机制密切相关。第二部分MCT4在癫痫发病中的作用分析目的：研究MCT4在癫痫发病中的作用。方法：建立大鼠皮层星形胶质细胞原代培养模型，在模型建立成功后将含有MCT4shRNA的慢病毒颗粒感染原代培养星形胶质细胞，然后通过细胞免疫荧光方法检测鉴定。利用MTT方法验证干涉MCT4对大鼠星形胶质细胞增殖能力的影响。同时采用流式细胞仪技术，验证干涉MCT4对大鼠星形胶质细胞凋亡及细胞周期影响。利用MCT4阻断剂阻断MCT4信号，观察阻断MCT4信号对神经元电活动影响。结果：成功构建MCT4干涉的原代培养的星形胶质细胞模型，MTT结果显示原代星形胶质细胞干涉MCT4后，细胞增殖能力显著减弱。流式结果证实原代细胞中干涉MCT4后，显著促进细胞凋亡。流式结果也证实原代细胞中干涉MCT4后导致细胞发生G1期阻滞。膜片钳结果证明：给予癫痫大鼠海马MCT4信号阻断剂后，神经元兴奋性增加。结论：在大鼠的原代培养星形胶质细胞中干涉MCT4可以导致细胞增殖能力减弱，流式细胞仪技术分析显示干涉MCT4促进细胞凋亡并且导致细胞发生G1期阻滞。而且干涉MCT4后促使神经元兴奋性增高。这些结果提示MCT4在正常星形胶质细胞的增殖、凋亡以及细胞周期方面扮演重要作用，并且MCT4表达对维持正常神经元兴奋性表达起到重要作用，因此MCT4在癫痫患者病灶中表达减少，可能是癫痫反复发作的一个重要原因。第三部分MCT4在癫痫发病中调控机制研究目的：研究MCT4在癫痫发病中调控机制研究。方法：建立大鼠皮层星形胶质细胞原代培养模型，在模型建立成功后将含有MCT4shRNA的慢病毒颗粒感染原代培养星形胶质细胞，然后收集蛋白利用西式印迹方法检测EAAT1表达情况。利用免疫共沉淀检测星形胶质细胞中MCT4是否和EAAT1相互结合。同时对所用癫痫样本进行免疫组织化学染色，检测MCT4和EAAT1在癫痫样本中表达情况。在原代培养的星形胶质细胞中加入放线菌酮，观察干涉MCT4后对EAAT1稳定性是否有影响。结果：大鼠星胶质细胞中干涉MCT4后可以导致EAAT1表达降低，免疫共沉淀证明了在原代培养星形胶质细胞中MCT4和EAAT1是相互结合的。免疫组织化学证实癫痫病灶中MCT4和EAAT1表达具有临床相关性。放线菌酮实验证实，在原代培养的星形胶质细胞中干涉MCT4可以导致EAAT1稳定性减弱。结论：星形胶质细胞中干涉MCT4可以导致EAAT1表达减少，并且免疫共沉淀也证实了在星形胶质细胞中EAAT1和MCT4相互作用，这提示在星形胶质细胞中MCT4可能调控EAAT1表达。斯皮尔曼等级相关性分析证实了MCT4和EAAT1在癫痫病灶中的表达具有临床相关性。放线菌酮实验进一步证实了在星形胶质细胞中干涉MCT4可以影响EAAT1转录后的稳定性。以上实验从多方向说明了MCT4和EAAT1密切相关，可能调控EAAT1表达，为临床上以MCT4为新的药物靶点开发新的抗癫痫药物提供充分的证据。