循环无细胞DNA对卵巢上皮性癌患者的诊断、疗效评价和病情监测的价值

论文摘要

目的:卵巢上皮性癌（epithelial ovarian cancer,EOC）早期诊断困难,5年生存率长期徘徊在30%左右。目前临床常用的诊断和监测指标是血清CA125,但由于CA125存在一定的局限性且缺乏特异性,因此长期以来临床上亟需一个更灵敏的卵巢上皮性癌诊断和病情监测的血清学指标。循环无细胞DNA（circulating cell-free DNA, cfDNA）是存在于体液中的,来源于凋亡和坏死的肿瘤细胞的碎裂核酸片段。近来的研究表明在头颈癌、肺癌、和结肠癌患者的血清中可以检测到肿瘤特异性改变的cfDNA。重要的是,这种改变不仅存在于癌症转移患者的血清中而且也存在于早期原发癌症患者的血清中。对乳腺癌的研究发现血清中的肿瘤相关cfDNA可以用ALU247/ALU115的比值代表,并证明其与疾病进展和瘤负荷呈正相关。ALU是一种重复序列,它是人类基因组中的散布元件,占基因总量的10%以上,典型的ALU重复序列有三百个碱基,能够特异性地被ALU内切酶所切割形成核酸片段,因此,理论上说,含有这一重复序列的DNA片段在血清中出现的几率最高,具有普遍意义。研究发现,循环中高表达的肿瘤相关抗原,其相应的基因组特定部位也处于高表达状态,由于肿瘤细胞的坏死和凋亡,可以将高表达的基因片段释放入循环,由此检测相应的cfDNA的数量和性质,可以为恶性肿瘤的诊断及鉴别诊断提供依据。为了找到卵巢上皮性癌患者血清中特异性的cfDNA,我们针对临床常用的诊断和监测指标血清CA125蛋白的基因序列设计了101 bp、261 bp、189 bp和336 bp四组DNA片段引物,采用半定量PCR方法检测卵巢上皮性癌患者、人卵巢癌裸鼠移植瘤模型血清和腹水中CA125基因片段（CA125-cfDNA）的含量及肿瘤相关cfDNA（ALU247/ALU115）的值,探讨其与卵巢上皮性癌鉴别诊断、临床分期,病理学类型和疾病进展的关系,研究血清中CA125-cfDNA及肿瘤相关cfDNA水平在卵巢上皮性癌临床诊断及病情监测中的意义。同时检测这两种血清cfDNA在卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肌瘤、子宫内膜异位症、复发卵巢癌、直肠癌患者血清中的含量,并与血清CA125蛋白的值进行相关性分析,横向对比分析CA125-cfDNA及肿瘤相关cfDNA是否可以辅助CA125蛋白为卵巢上皮性癌的诊断、疗效评价和病情监测提供依据。本实验共分为三个部分:第一部分卵巢上皮性癌患者循环无细胞DNA的检测及临床意义目的:检测循环无细胞DNA中的肿瘤相关cfDNA（ALU247/ALU115）及CA-125基因片段（CA125-cfDNA）在卵巢上皮性癌患者血清中的含量,探讨其与卵巢上皮性癌鉴别诊断、临床分期,病理学类型和疾病进展的关系,研究二者是否可作为卵巢上皮性癌早期诊断及病情监测的指标。方法:采用半定量PCR方法检测60例卵巢上皮性癌,35例良性卵巢上皮性肿瘤,30例正常对照组血清及26例晚期卵巢癌患者未经化疗腹水中游离的ALU 247、ALU115、β-actin、CA125 DNA片段的表达。血清CA125的检测为常规的酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测法。结果:1肿瘤相关cfDNA、CA125-cfDNA在卵巢上皮性癌组、卵巢良性肿瘤组和正常对照组血清中的表达卵巢上皮性癌患者术前血清肿瘤相关cfDNA、CA125-cfDNA的水平显著高于正常对照组（P=0.000, P<0.05）,CA125-cfDNA在卵巢良性肿瘤的含量与正常对照组相比无统计学差异（P=1.000, P>0.05）,肿瘤相关cfDNA在卵巢良性肿瘤的表达高于正常对照组（P=0.019, P<0.05）。血清CA125-cfDNA在晚期卵巢上皮性癌患者腹水中的值显著高于同组血清中的值（P=1.000, P<0.05）。2肿瘤相关cfDNA、CA125-cfDNA在卵巢上皮性癌患者术前、术后及化疗两程后血清中的含量卵巢上皮性癌患者血清术前及术后肿瘤相关cfDNA、CA125-cfDNA的水平显著高于正常对照组及术后化疗二程组（P=0.009, P<0.05）,化疗二程后明显高于健康对照组（P=0.012, P<0.05）,术前、术后比较无显著性差异（P=0.953, P>0.05）。3肿瘤相关cfDNA、CA125-cfDNA含量与卵巢上皮性癌手术病理分期、病理学分级和类型的关系III-IV期卵巢上皮性癌患者的肿瘤相关cfDNA和CA125-cfDNA的水平显著高于I-II期（t=-4.250, P=0,000, P<0.05）,二者与卵巢上皮性癌的病理学类型及病理分级间无统计学差异（F=2.641, P=0.08, P>0.05）。血清CA125-cfDNA在卵巢粘液性囊腺癌中的水平显著高于正常对照组（t=4.605, P=0.001, P<0.05）。4卵巢癌肿瘤相关cfDNA、CA125-cfDNA水平与血清CA125的相关性比较卵巢上皮性癌患者术前血清CA125的值与血清CA125-cfDNA的值存在相关性（P<0.05）,与肿瘤相关cfDNA的值无相关性（P>0.05）。卵巢上皮性癌患者化疗2疗程后血清CA125的值与血清CA125-cfDNA的值存在相关性（P<0.05）,与肿瘤相关cfDNA的值无相关性（P>0.05）。结论:1肿瘤相关cfDNA、CA125-cfDNA在卵巢上皮性癌患者血清中水平显著升高,可能与瘤负荷呈正相关。2血清CA125-cfDNA术前和化疗两疗程后的值与血清CA125的值有较好的相关性,而肿瘤相关cfDNA与血清CA125不存在相关性,因此肿瘤相关cfDNA和CA125-cfDNA有望成为卵巢上皮性癌病情监测新的分子标记物,可以辅助血清CA125用于卵巢上皮性癌的诊断、鉴别诊断和病情监测。3 CA125在粘液性卵巢癌中的表达往往趋于正常值,然而在CA125的值正常的4例粘液性卵巢癌中,CA125-cfDNA有2例较正常均值有明显升高,肿瘤相关cfDNA有3例升高,因此二者可能在卵巢粘液性癌的诊断及病情监测中发挥重要作用。第二部分人卵巢癌移植瘤裸鼠模型中循环无细胞DNA与瘤负荷、凋亡的关系及其血流动力学改变目的:研究人卵巢癌移植瘤裸鼠模型血清及腹水中cfDNA的血流动力学改变及其与瘤负荷和癌细胞凋亡的关系。方法:将人卵巢癌细胞株SKOV3种植于6-8周龄雌性裸鼠的皮下及腹腔中,观察裸鼠成瘤和肿瘤生长情况。分别于14天（荷瘤1组）,21天（荷瘤2组）和30天（荷瘤3组）取皮下种植瘤模型血清及肿瘤,14天取腹水种植瘤模型血清和腹水,皮下种植瘤模型化疗组在种植后第30天用顺铂化疗1次,于化疗后第1天（化疗1组）,第3天（化疗2组）和第10天（化疗3组）取血清及肿瘤。应用半定量PCR法检测荷瘤1、2、3组;化疗1、2、3组和腹水组的血清及腹水组腹水中cfDNA的含量,与相应的肿瘤重量进行对比,用TUNNEL法检测化疗1、2、3组及荷瘤1组组织细胞的原位凋亡,将其凋亡率与相应的cfDNA含量及重量进行相关性分析。结果:1各组基因片段在成瘤裸鼠血清及腹水中的表达情况裸鼠血清及腹水中β-actin、ALU247、ALU115、以及CA125-cfDNA中的101bp片段在各组均有表达,CA125-cfDNA中的261bp片段表达阳性率达51.25%（80例中有41例可见特异性条带）,189 bp及336 bp片段基本没有表达。CA125-cfDNA101 bp及肿瘤相关cfDNA在腹水中的表达与同一个体的血清值相比没有显著性差异（P>0.05）。2血清cfDNA水平与瘤负荷的关系瘤负荷1、2、3组裸鼠血清中的CA125-cfDNA 101bp片段及肿瘤相关cfDNA与肿瘤重量呈正相关（CA125-cfDNA 101bp片段R=0.830,肿瘤相关cfDNA的R=780）,差异均有显著性（p<0.05）。3血清cfDNA在化疗后的变化情况血清CA125-cfDNA的101 bp片段及肿瘤相关cfDNA在化疗后第1天达最大值,而后缓慢下降,在化疗第10天其值明显低于化疗前水平,差异有显著性（CA125-cfDNA的P=0.047,肿瘤相关cfDNA的P=0.013,均<0.05）。4化疗后血清cfDNA水平与肿瘤细胞凋亡的关系化疗前后血清CA125-cfDNA 101 bp片段及肿瘤相关cfDNA与肿瘤细胞的凋亡率呈正相关（P<0.05）。结论: 1成瘤裸鼠血清及腹水中可以检测到人卵巢癌细胞株的人类特异性cfDNA,其含量在化疗后先显著升高而后下降,并与tunel检测的凋亡率呈正相关,由此可以证实cfDNA来源于肿瘤细胞,并与其凋亡和坏死有关。2血清中CA125-cfDNA中101 bp片段及肿瘤相关cfDNA的含量与瘤负荷呈正相关,有可能为卵巢上皮性癌的诊断及病情监测提供理论依据。第三部分循环无细胞DNA与CA125的相关性研究及其在妇科各类疾病中的表达状况分析目的:对比妇科各类良恶性疾病及结直肠癌患者血清的肿瘤相关cfDNA及CA125-cfDNA的含量,并与血清CA125的值进行相关性分析。方法:应用半定量PCR法检测60例卵巢癌、18例宫颈癌、15例子宫内膜癌、15例子宫肌瘤、26例子宫内膜异位症、8例复发卵巢癌、12例结直肠癌患者、35例卵巢良性肿瘤患者及30例正常人血清中肿瘤相关cfDNA及CA125-cfDNA261 bp片段的含量,分析这两项指标在妇科各类良恶性疾病中的表达情况及与血清CA125蛋白含量的相关性,进而推断二者是否可以辅助血清CA125成为卵巢上皮性癌的特异性检测指标。结果:1血清CA125-cfDNA在各类疾病中的含量变化及与CA125的相关性分析血清CA125-cfDNA的含量在卵巢癌、复发性卵巢癌中显著升高,与正常人及卵巢良性肿瘤有显著性差异（P<0.05）。在子宫内膜癌、子宫内膜异位症及结直肠癌中表达轻度升高,与正常人相比有显著性差异（P<0.05）。在宫颈癌、子宫肌瘤的患者血清中表达极少。血清CA125-cfDNA的含量与血清CA125蛋白存在正相关关系（P<0.05）。2血清肿瘤相关cfDNA在各类疾病中的含量变化及与CA125的相关性分析血清肿瘤相关cfDNA的含量在卵巢癌、复发性卵巢癌、直肠癌、子宫内膜癌及宫颈癌等各类实体瘤性癌症患者血清中均有升高,各组癌症患者之间比较,差异没有显著性（P>0.05）。各组与卵巢良性肿瘤组和正常对照组相比,差异有显著性（P<0.05）。与CA125不存在正相关关系（P>0.05）。结论:1血清CA125-cfDNA及肿瘤相关cfDNA的检测可以辅助CA125在卵巢癌患者的诊断及病情监测中具有临床应用价值。2血清肿瘤相关cfDNA是否可以作为一项癌症的普查手段尚需进一步研究证实。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 研究论文 循环无细胞DNA 对卵巢上皮性癌患者的诊断、疗效评价和病情监测的价值
• 引言
• 第一部分 卵巢上皮性癌患者循环无细胞 DNA 的检测及临床意义
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 人卵巢癌移植瘤裸鼠模型中循环无细胞DNA 与瘤负荷、凋亡的关系及其血流动力学改变
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 循环无细胞 DNA 与 CA125 的相关性研究及其在妇科各类疾病中的表达状况分析
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 综述
• 致谢
• 个人简历