用DefH9-iaaM5基因和Rol ABC基因转化沙田柚的研究

论文摘要

沙田柚（Citrus grandis var.shatinyou Hour）是芸香科柑桔属中著名的柚类良种，在我国栽培历史悠久，品种繁多，栽种范围广，面积大，年产量1866985吨，远销东南亚，但由于其种子多，平均每个果实种子数约为120多粒，严重影响了其商品价值和在国际市场上的竞争能力；此外，沙田柚树体高大，不便管理，生产成本较高。因此，增加无核和矮化性状已成为沙田柚遗传改良的重要研究课题。本文以沙田柚为应用研究对象，通过对离体再生条件、抗生素筛选条件以及根癌农杆菌介导沙田柚遗传转化条件的优化，建立了高效的离体再生系统和遗传转化体系，并将DefH9-iaaM5无核基因和Rol ABC矮化基因导入沙田柚，对转化植株进行了分子检测，主要研究内容及结果如下：1．研究了外植体的离体再生系统。建立了沙田柚无菌苗繁殖体系，并对外植体不定芽再生能力以及基本培养基、6-BA浓度、激素组合和活性碳等因素对上胚轴不定芽再生能力的影响进行了比较，筛选出沙田柚上胚轴为离体再生体系最佳外植体，其分化不定芽的适宜培养基为MS+3mg·L-16-BA。2．通过卡拉霉素敏感性试验，确定了沙田柚上胚轴外植体不定芽诱导的卡拉霉素临界耐受浓度为75mg·L-1，同时研究了头孢霉素（Cef）和羧苄青霉素（Cb）对沙田柚上胚轴不定芽芽诱导和农杆菌抑菌效果的影响，发现两种脱菌剂浓度超过500mg·L-1时对上胚轴外植体不定芽的诱导有抑制作用，而且随着浓度升高抑制程度加大。抑菌试验表明，Cef对EHA105和C85菌株的抑菌效果比Cb好，适宜的脱菌浓度为500mg·L-1。3．通对影响农杆菌转化效率几个主要因素进行的研究发现，沙田柚上胚轴外植体在侵染前预培养2d、农杆菌侵染时浓度OD600值为0.5、侵染15min、侵染后共培养2～4d可获得较好的转化效果，在共培养基中附加200μmol·L-1乙酰丁香酮对转化效果无明显的影响。4．将通过共培的上胚轴在MS+3mg·L-16-BA+75mg·L-1Kan+500mg·L-1 Cef筛选培养后的抗性芽，利用茎尖微芽嫁接的方法，嫁接到卡里佐枳橙上成苗，目前在温室生长良好。经过PCR扩增检测，获得31株转DefH9-iaaM5基因植株和9株转Rol ABC基因植株，转化率分别为1.73％和3.19％。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 沙田柚生产概况
• 2 植物遗传转化的研究进展
• 2.1 利用载体系统遗传转化
• 2.2 直接遗传转化
• 3 柑橘遗传转化的研究进展
• 4 本研究目的及意义
• 4.1 无核研究目的及意义
• 4.2 矮化研究目的及意义
• 5 本研究的主要内容
• 第二章 沙田柚离体再生体系的建立
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 生化试剂
• 1.3 主要仪器和设备
• 1.4 培养基
• 2 实验方法
• 2.1 沙田柚无菌苗繁殖体系的建立
• 2.2 外植体不定芽再生能力的比较
• 2.3 基本培养基对上胚轴不定芽再生能力的影响
• 2.4 6-BA浓度对上胚轴不定芽再生能力的影响
• 2.5 激素组合对上胚轴不定芽再生能力的影响
• 2.6 活性炭对上胚轴不定芽再生能力的影响
• 3 结果与分析
• 3.1 外植体不定芽再生率的影响
• 3.2 基本培养基对上胚轴不定芽再生率的影响
• 3.3 6-BA浓度对上胚轴不定芽再生率的影响
• 3.4 激素组合对上胚轴不定芽再生率的影响
• 3.5 活性炭对上胚轴不定芽再生的影响
• 4 讨论
• 第三章 沙田柚遗传转化体系的建立与优化
• 1 实验材料
• 1.1 植物受体材料
• 1.2 质粒和农杆菌菌株
• 1.3 生化试剂
• 1.4 主要仪器和设备
• 2 实验方法
• 2.1 根癌农杆菌的活化及工程菌液的制备
• 2.2 上胚轴不定芽诱导对卡拉霉素筛选剂的敏感性
• 2.3 抗生素对农杆菌的抑制作用
• 2.4 转化方法和转化条件的优化
• 2.4.1 外值体的预培养
• 2.4.2 适宜共培养时间的确定
• 2.4.3 共培培养基中加入乙酰丁香酮对转化效果的影响
• 2.4.4 菌液浓度对转化效果的影响
• 2.4.5 侵染时间对转化效果的影响
• 2.5 农杆菌介导的基因转化
• 3 结果与分析
• 3.1 农杆菌菌株对转化的影响
• 3.2 上胚轴不定芽诱导对卡拉霉素筛选剂的敏感性
• 3.3 头孢霉素和羧苄青霉素对农杆菌的抑菌效果
• 3.4 预培养对转化的影响
• 3.5 适宜共培养时间的确定
• 3.6 乙酰丁香酮对转化效果的影响
• 3.7 农杆菌菌液浓度对转化的影响
• 3.8 侵染时间对转化效果的影响
• 3.9 抗性芽的获得
• 4 抗性芽的成苗
• 5 讨论
• 5.1 抗生素的使用
• 5.2 预培养的作用
• 5.3 乙酰丁香酮的作用
• 5.4 小结
• 第四章 转基因植株的分子检测
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 生化试剂
• 1.3 扩增引物
• 1.4 主要仪器和设备
• 2 实验方法
• 2.1 质粒 DNA的提取
• 2.2 转化植株基因组 DNA提取
• 2.3 PCR分子检测
• 2.3.1 PCR反应体系
• 2.3.2 npt II、DefH9-iaaM5、Rol B和 Rol C基因 PCR扩增程序
• 2.3.3 Rol A基因 PCR扩增程序
• 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳
• 3 结果分析
• 3.1 适合于 PCR的 DNA的制备
• 3.2 转化植株 PCR检测结果
• 4 讨论
• 第五章 总结
• 参考文献
• 附录 常用培养基配方
• 图版
• 致谢