酶法制备谷朊蛋白ACE抑制肽工艺研究

论文摘要

血管紧张素转换酶（Angiotensin Converting Enzyme,ACE）对人体血压调节起到重要作用,目前,许多ACE抑制剂被用来预防和治疗高血压。源自食品的血管紧张素转换酶抑制肽具有安全性高、无副作用等优点,已成为一个研究热点。本文利用酶水解法从谷朊粉蛋白中制备ACE抑制活性肽,并通过一系列分离手段得到了高抑制活性谷朊蛋白抑制肽。主要研究内容如下:首先通过差速离心、脱氧胆酸钠增溶、硫酸铵分级沉淀等方法从兔肺中分离提取出血管紧张素转换酶,作为实验活性筛选用酶,其比活力为2.5U/mg。以ACE抑制率为指标,从多种蛋白酶中筛选出一种碱性蛋白酶（PT-1）为制备ACE抑制肽的最佳用酶,并采用响应面分析实验,以ACE抑制率和水解度为指标,对PT-1水解谷朊蛋白的条件进行了优化,得出酶法制备ACE的最优条件。利用截留分子量分别为12KDa、5KDa、3KDa的超滤膜对ACE抑制肽进行分离,使ACE抑制率提高了73.4%。利用截留分子量为300Da纳滤膜脱除大部分盐离子和氨基酸,进一步提高ACE抑制率74.9%。因而,膜分离是高效分离提纯ACE抑制肽的一项有力工具。使用羧甲基纤维素对ACE抑制肽进行离子交换层析,洗脱产物IC50为0.066 mg/mL。实验采用RP-HPLC对该组分进一步分离,建立了良好的色谱条件,获得了分离度较好RP-HPLC肽谱图。对肾性高血压大鼠（RHR）以2.0g/（kg·d）一次性灌胃,连续一个星期后,RHR大鼠动脉压保持在130～140 mmHg之间,心率、体重无明显变化。对原发性高血压大鼠（SHR）给药4周后,收缩压（SAP）从168.55 mmHg持续下降到149.11±1.41mmHg,与空白对照相比,SAP下降25±5.32 mmHg,而舒张压变化不大。数据表明,谷朊蛋白肽对降低并维持大鼠正常血压有着良好的促进和辅助作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 血管紧张素转换酶（ACE）在血压调控体系中的作用
• 2 血管紧张素转化酶抑制肽（ACEIP）研究进展
• 2.1 蛇毒ACEIP
• 2.2 食源性ACEIP
• 2.3 ACEIP的构效关系
• 2.4 ACEI肽活性评价
• 2.5 食源性ACEIP的特点
• 2.6 ACEIP的开发方向和发展前景
• 3 谷朊粉的研究、开发和应用概况
• 3.1 谷朊粉的应用
• 3.2 谷朊粉的化学改性和酶法加工
• 4 本研究选题意义和主要研究内容
• 第二章 谷朊蛋白ACEIP的酶法制备
• 1 材料与方法
• 1.1 材料试剂
• 1.2 试剂配制
• 1.3 仪器
• 1.4 试验方法
• 1.4.1 蛋白质含量测定
• 1.4.2 粗脂肪含量测定
• 1.4.3 水分含量测定
• 1.4.4 肽含量测定
• 1.4.5 水解度（DH）的测定
• 1.4.6 ACE酶活测定
• 1.4.7 ACE抑制率的体外测定
• 1.4.8 酶解谷朊蛋白
• 1.4.9 兔肺血管紧张素转换酶（ACE）制备
• 1.4.10 实验蛋白酶品种的筛选
• 1.4.11 酶解工艺的优化
• 2 结果与分析
• 2.1 谷朊粉成分测定
• 2.2 兔肺血管紧张素转换酶制备和活力测定
• 2.3 制备ACEIP的蛋白酶品种筛选
• 2.4 碱性蛋白酶水解谷朊粉条件研究
• 2.4.1 水解时间对ACEIP活性的影响
• 2.4.2 反应体系PH对ACEIP活性的影响
• 2.4.3 反应温度对ACEIP活性的影响
• 2.4.4 酶浓度对酶解产物活性的影响
• 2.4.5 底物浓度对对产物活性的影响
• 2.5 响应面实验对酶解条件的优化
• 2.5.1 因素选择和水平设定
• 2.5.2 实验设计和结果
• 2.5.3 模型建立和评价
• 2.5.4 实验条件优化及模型预测
• 3 讨论
• 第三章 超滤、纳滤膜分离技术的应用
• 1 材料与方法
• 1.1 材料试剂
• 1.2 主要仪器和设备
• 1.3 试验方法
• 1.3.1 超滤实验方法
• 1.3.2 纳滤实验方法
• 1.3.3 膜通量的计算方法
• 1.3.4 纳滤膜脱盐率计算方法
• 1.3.5 滤液中肚含量测定
• 2 实验结果与讨论
• 2.1 超滤实验结果
• 2.1.1 超滤通量随时间的变化
• 2.1.2 膜分离过程中温度的变化
• 2.1.3 超滤产物的肽回收率
• 2.1.4 超滤产物ACE抑制活性
• 2.2 纳滤实验结果
• 2.2.1 通量随时间的变化
• 2.2.2 膜分离过程中温度的变化
• 2.2.3 纳滤浓缩作用
• 2.2.4 纳滤脱盐作用
• 2.2.5 纳滤液ACE抑制活性变化
• 2.3 结论
• 第四章 离子交换和RP-HPLC对谷朊蛋白ACEIP组分的分离研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 试验方法
• 1.3.1 离子交换介质的选择
• 1.3.2 离子交换树脂的处理方法
• 1.3.4 CM纤维素离子交换层析方法
• 1.3.5 离子交换树脂PH测定方法
• 1.3.6 RP-HPLC色谱条件和方法
• 2 实验结果与讨论
• 2.1 离子交换树脂PH测定结果
• 2.2 CM-52纤维素的检测结果
• 2.3 离子交换层析二次分离
• 2.4 RP-HPLC对过程组分的分析
• 2.4.1 谷朊蛋白水解原液的RP-HPLC肽谱分析
• 2.4.2 膜分离P7组分的RP-HPLC肽谱
• 2.4.3 离交层析组分的RP-HPLC肽谱
• 2.4.4 RP-HPLC的分步收集对ACEIP组分的制备
• 3 讨论
• 3.1 谷朊蛋白ACEIP制备过程活性变化
• 3.2 RP-HPLC对ACEIP组分分离和组成鉴别
• 第五章 谷朊蛋白ACEIP对高血压大鼠降压活性初步研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 试验方法
• 1.3.1 灌胃前准备及饲养条件
• 1.3.2 肾性高血压大鼠降压活性预测实验
• 1.3.3 实验用谷朊蛋白ACE抑制活性肽配制
• 1.3.4 原发性高血压大鼠（SHR）血压的测定方法
• 1.3.5 原发性高血压大鼠（SHR）一次性给药剂量实验设计
• 1.3.6 原发性高血压大鼠（SHR）长期给药动物实验设计
• 2 实验结果
• 2.1 实验用肾性高血压大鼠基本情况
• 2.2 肾性高血压大鼠降压实验结果
• 2.3 原发性高血压大鼠（SHR）30D饲喂实验
• 2.3.1 原发性大鼠0.5G/（KG·D）剂量试验结果
• 2.3.2 原发性大鼠1.0G/（KG·D）剂量试验结果
• 2.3.3 原发性大鼠2.0G/（KG·D）剂量试验结果
• 2.3.4 原发性大鼠30D饲喂试验结果
• 3 讨论
• 全文总结
• 实验创新点及工作展望
• 参考文献
• 致谢
• 附硕士期间发表论文