XIAP在肝癌组织的异常表达及对肝癌细胞调控的研究

论文摘要

引言肝癌,作为世界上第五种常见的恶性肿瘤,高居癌症致死原因中的第三位,占据成人肝脏恶性肿瘤的80%[1]。它的五年存活率是7%,每年可导致将近600,000人死亡[2]。虽然非洲和亚洲是肝癌的高发地,但是近些年在西方国家由于酒精性肝炎和HCV感染的增多,肝癌的发病率也在逐年上升[3]。肝癌有几种常见的流行病学特征:发病趋势的动态性,基因突变区域的多样性,种族和人群的差异,男性和女性发病率的差异,几种常见的环境危险因子[4]。肝癌基因表达网络的建立,作为一项新的研究成果,已经为肝癌病人的诊断和预后提供了很好的平台[6]。如我们所期望的那样,基于基因表达网络建立的生物模型,能够精确的区分肝癌组织和非肝癌组织[7]。依据病因因子[8]、肿瘤抑制基因的变异[9]、复发率[10]、肝功能代谢[11]、肿瘤分期[12],不同的肝癌基因表达已经被确认。但是,大多数这些研究只是涉及了肝癌基因表达的某些侧面,没有反映触发肿瘤形成的本质的生物学特性。这是因为mRNA水平不能精确地反映蛋白分子水平,也不能反映病因学分子转录水平上的蛋白质改变和蛋白质分子降解水平上的改变。因此,分析肿瘤细胞和正常细胞间的蛋白质分子水平的改变,对于进一步完善肝癌基因表达网络就显得非常的重要。PathwayArray技术作为一项创新性的技术,能够对蛋白质分子进行大规模的筛选。此项技术主要是应用于研究与肿瘤发展（发生、浸润、转移）相关的信号传导通路。肿瘤细胞中高表达的蛋白分子与血管生成、细胞凋亡、细胞周期、DNA修复、转移、细胞增殖、信号传导、干细胞的分化都具有功能上的相关性。本课题主要是应用此项技术研究肝癌组织和肝癌细胞当中的蛋白质分子表达水平。肝癌作为慢性肝损伤的晚期阶段,以肝小叶周边多核肝癌细胞的浸润性生长和毗邻细胞凋亡抑制为主要特征。凋亡的抑制对于经受基因损伤和细胞形态学改变后的肝细胞的存活具有非常重要的作用,它们可以通过细胞的再生而保持高速的增殖[33,34]。事实上,肝癌细胞对于各种诱导凋亡的刺激都保持着很强的耐受性[35,36]。但是,目前对于肝癌细胞的抗凋亡机制的研究还不是很清楚。最近的许多研究表明,凋亡抑制子（IAP）在凋亡的分子调节机制中起着非常重要的作用。到目前为止,6种人类IAP蛋白,即XIAP、c-IAP1、c-IAP2、NAIP、survivin和Apollon都已经得到证实[38-42]。它们通常有1-3个由70个氨基酸组成的模体和一个BIR结构域;而其BIR结构域与杆状病毒IAP蛋白序列具有高度的同源性,在与caspases结合及抑制caspases作用方面,特别是caspases3和caspases7,具有非常重要的作用[43]。另外,c-IAP1和c-IAP2在酵母双杂交系统中可以与TRAF-1和TRAF-2相结合;这就表明c-IAP1和c-IAP2可以通过TRAF参与TNF诱导的NF-κB激活的调节[43]。XIAP蛋白包含有3个BIR结构域和1个环形指状结构域,与c-IAP1和c-IAP2相比,它具有更强的抑制caspase3和caspases7的作用[44-46]。XIAP的mRNA表达水平在除外周血淋巴组织外几乎所有的人类组织当中都得到了检测,这说明XIAP作为IAP家族的成员之一,是其中最具代表性的一种[43]。但是,关于XIAP在肝癌组织当中的蛋白表达水平和其在肝癌细胞调控方面的研究却很少[43,47]。我们将利用pathway array技术检测XIAP在肝癌组织当中的表达水平,同时在体外进行肝癌细胞的XIAP小分子RNA干扰研究,观察在特异性基因表达被敲低后,对肝癌肿瘤细胞增殖、周期、凋亡和其它蛋白质表达的影响情况;从而更深一步明确其在肝癌发生、发展、演进方面的作用。方法1、收集13个肝癌病人的组织标本,包括肝癌组织和肝癌旁正常组织,进行pathway array实验,研究其组织当中的蛋白质分子表达水平;2、根据pathwayarray结果,选取XIAP作为切入点,利用小分子RNA干扰技术,特异性敲低XIAP在hepG2/2.2.1（human hepatocellular carcinoma）细胞株中的基因表达水平,通过RT-PCR技术证实其表达情况;3、XIAP siRNA成功转染后,进行cellviability analysis,研究XIAP在肝癌细胞增殖方面的作用;4、XIAP siRNA成功转染后,进行cell cycle analysis,研究XIAP在肝癌细胞周期方面的作用;5、XIAPsiRNA成功转染后,进行cell apoptosis analysis,研究XIAP在肝癌细胞凋亡方面的作用;6、XIAP siRNA成功转染后,进行pathway array实验,研究XIAP基因表达敲低后,对肝癌细胞中其它蛋白质分子表达的影响情况。结果1、13对标本当中,每对标本我们都杂交了44种磷酸化和非磷酸化蛋白,共检测到23种蛋白,其中存在两倍以上变化的蛋白有22种,其中XIAP、BRCA1、PCNA在肝癌组织中明显的高表达;2、在XIAP siRNA转染进hepG2/2.2.1细胞株后,通过RT-PCR技术,检测到肝癌细胞当中的XIAP基因表达水平被明显敲低;3、XIAP siRNA成功转染后,与对照组相比较,实验组中肝癌细胞数明显减少（P＜0.05）,故证明XIAP有促进肝癌细胞增殖的作用;4、XIAP siRNA成功转染后,与对照组相比较,XIAP siRNA实验组出现了G1 arrest,证明XIAP也参与肝癌细胞周期的调节;5、XIAP siRNA成功转染后,与对照组比较,XIAPsiRNA实验组出现了较多坏死细胞,证明XIAP也参与肝癌细胞凋亡的调节;6、XIAP siRNA成功转染后,进行pathway array分析,我们杂交了66种磷酸化和非磷酸化蛋白,共检测到26种蛋白,其中存在两倍以上变化的蛋白有6种。XIAP可以下调ETS1的表达,同时可以上调cdk6、CHK1、CREB、p53和p38的表达。结论1、在肝癌组织中,可以发现有多种蛋白质分子的异常表达。其中XIAP、BRCA1、PCNA在肝癌组织中明显的高表达。2、XIAP参于肝癌细胞的增殖、周期、凋亡的调节,可以下调ETS1的表达,同时可以上调cdk6、CHK1、CREB、p53和p38的表达,。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料方法
• 结果
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 缩写词表
• 致谢
• 统计学证明