论文摘要
在细胞膜表面存在大量糖缀合物，介导机体的生理及病理过程，如精卵识别、淋巴细胞归巢、细菌与宿主细胞间黏附、炎症反应以及胚胎着床等。Lewis聚糖是岩藻糖化的乳糖系列聚糖，根据其糖链结构不同分为LeX、LeY、Lea、Leb、sLeX等，而LeX、LeY的差异只是末端岩藻糖Fucα1-2的有无。Lewis聚糖与个体发育、器官形成、造血细胞分化及肿瘤发生转移密切相关。本实验室前期Lewis聚糖在雌性生殖系统中的功能研究显示：岩藻聚糖抗原LeY在着床期的子宫内膜细胞和胚泡中持续高表达，在卵巢激素调节下作为信息分子参与母-胎识别、黏附和调控着床。催化Lewis聚糖合成的关键酶（岩藻糖基转移酶futs）在围着床期子宫内膜表达趋势与Lewis聚糖蛋白表达一致，说明聚糖合成受其合成关键酶基因调控。精子离开睾丸时虽然高度分化但并未完全成熟，其在通过附睾管运行过程中，与附睾管腔液的微环境相互作用，获得前向运动能力和使卵子受精的潜能。精子成熟过程主要在附睾完成，附睾头部又是精子成熟主要发生区域。附睾上皮分泌的蛋白通过参与精子质膜在顶体反应、精卵识别和融合作用来调控精子的成熟和获能。文献报道人精浆中含有0.3-0.4mg／ml游离岩藻聚糖，并富含LeX和LeY的抗原决定基和大量糖基转移酶。本文采用c57鼠睾丸、附睾组织作为研究对象，利用LeX和LeY两种单克隆抗体，通过免疫组织化学、RT-PCR、Western-blot等技术，分析岩藻聚糖的来源及定位，探讨精浆中的岩藻聚糖与精子发育成熟的相关性，得到以下结果：（一）免疫组织化学检测LeX和LeY在小鼠睾丸、附睾不同区域（头部、体部、尾部）的表达，结果显示：在小鼠睾丸中没有LeX和LeY表达，而在附睾头部及其腔内所含的精子表面则强烈表达，在附睾体部、尾部表达减弱，具有高度区域特异性。RT-PCR结果显示：LeX合成的关键酶fut9在附睾头部有强烈表达，体部及尾部表达减弱；LeY合成的关键酶fut1、fut4表达从附睾头部、体部和尾部呈逐渐降低趋势，同一种基因表达具有显著的区域特异性。鉴于岩藻糖化聚糖LeX和LeY主要表达在附睾头部，而附睾头部又是精子成熟主要发生区域，提示LeX及LeY在精子成熟过程具有重要作用。Western-blot结果显示：LeX分子量为30kDa～40kDa蛋白睾丸中强表达，附睾头部、体部及尾部呈逐渐降低：而分子量为40kDa～60kDa蛋白附睾头部、体部及尾部呈逐渐升高；LeY睾丸、附睾不同区域均有表达，50kDa左右蛋白在附睾头部、体部明显表达，而进入附睾尾部表达下降，60kDa～70kDa蛋白在附睾头部、体部、尾部呈逐渐降低，不同分子量的蛋白，表达趋势不同，推测其在各部位起的作用不同，总体来说附睾头部蛋白表达量高，而体部、尾部降低。综合分析这些结果，提示岩藻糖化聚糖主要在附睾头部表达，而精子成熟主要发生在附睾头部，推测其主要的生物学功能在附睾头部发挥，与精子在附睾头部成熟密切相关。（二） RT-PCR技术对青春期（5周、7周、11周）、成年期（6个月）、衰老期（400天）小鼠睾丸、附睾中岩藻糖基转移酶futs的表达分析显示：fut1、fut4在不同发育周期附睾头部、体部及尾部表达趋势基本一致，青春期表达低、成年期表达量最高、衰老期后表达下降，呈现随年龄变化波动趋势，这与生长发育各阶段激素变化相一致，表明基因表达受激素调控。fut9在不同发育周期附睾头部、尾部表达无明显变化趋势，而在不同发育周期的附睾体部表达呈趋势变化，即在青春期有表达，在成年期表达至高峰，进入衰老期表达下降，说明其可能在附睾体部发挥功效，其表达同样受激素调控。（三）免疫组化技术检测不同发育时期（3周、5周、7周、成熟期）小鼠睾丸、附睾中LeX和LeY表达发现：附睾头部LeX和LeY表达3周龄鼠弱，5周龄、7周龄以及进入成年期逐渐增多；附睾体部LeX表达3周龄弱，7周龄强，成年期减弱；而LeY在5周龄表达较强。附睾尾部LeX和LeY表达情况基本一致，则在3周龄表达强，随着生长发育进入各周期表达渐弱。3周龄鼠附睾上皮细胞处于分化期，附睾头部、体部、尾部细胞差异不明显，均以分泌LeX和LeY细胞为主，LeX和LeY表达在各部位没有明显的区域性差异。5周、7周龄鼠附睾上皮细胞处于增生期，附睾头部、体部细胞进一步分化，附睾头部、体部表达强，呈现一定程度的区域差异；成年鼠附睾上皮细胞分化完成，附睾头部、体部和尾部细胞表现出明显差异，LeX和LeY即在附睾头部主要表达，而附睾体部和尾部表达弱，提示其表达呈组织特异性。本研究进一步说明附睾头部为LeX和LeY主要表达部位，推测其可能有促进精子的成熟作用。精子成熟发生机制十分复杂，本课题研究结果提示岩藻糖化聚糖LeX和LeY与精子成熟有关，但其在精子成熟过程中的作用仍需继续探索。