骨髓间充质干细胞和成纤维细胞的蛋白质组学研究

论文摘要

实验背景骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Stem Cells, BMSCs）作为目前较理想的组织工程瓣膜间质细胞的种子细胞,相对于其他来源的种子细胞具有获取方便、很强的自我更新、多向分化潜能,以及独特的免疫特性等优点。正常心脏瓣膜间质细胞中的成纤维细胞对于维持正常心脏瓣膜的结构和功能具有更重要的意义。目前应用hBMSCs构建的组织工程心脏瓣膜多需移植入动物体内后一段时间才能完成组织工程瓣膜的成纤维细胞表型和基质的最后重塑,尚不清楚hBMSCs向成纤维细胞进行分化的具体机制以及其功能特点。BMSCs和成纤维细胞具有非常相似细胞形态、细胞表型特点及细胞表面分子。通过基因组学的方法研究发现在两种细胞中确实存在一些差异基因。蛋白质组,作为细胞基因组的最后表达,能够更详尽、更直接地描述细胞的结构和功能特点。目的采用蛋白质组学的方法全面比较hBMSCs和成纤维细胞中蛋白表达的差异,进一步在蛋白水平理解两种在细胞结构和功能差异。方法1.自正常人髂骨抽取骨髓,综合采用密度梯度离心和贴壁筛选的方法,分离、纯化出hBMSCs,在低糖DMEM/F12培养、扩增;倒置显微镜观察细胞生长,流式细胞仪检测表面抗原CD29、CD34和CD45,并对骨髓间充质干细胞进行成骨、成脂多向分化诱导,进行细胞性质鉴定。成纤维细胞是人成纤维细胞系细胞（购自Cell Applications公司）。2.对两种细胞的蛋白样本进行双向凝胶电泳分离,通过银染显色,获取两种细胞的蛋白组学图谱,通过比较两种细胞的图谱,挖取差异表达的蛋白点进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱肽质量指纹图分析和蛋白数据库信息检索。选取蛋白进行Western Blot和免疫组织化学实验验证蛋白质组学的研究结果。结果1.原代细胞呈贴壁,集落样生长;细胞传代后,呈梭形,少数细胞呈多角形,鱼群或放射状排列。hBMSCs的表面抗原CD29阳性而造血干细胞具有的表面抗原CD34和CD45为阴性;成骨和成脂诱导后,分别行Von kossa染色和油红-O染色结果呈阳性。实验从正反两方面论证、确认了所分离培养的细胞即为hBMSCs。2.hBMSCs和成纤维细胞全蛋白提取后,进行双向凝胶电泳分析,共进行3次实验得到银染结果,两种细胞的电泳图谱蛋白斑点分布模式具有一定的相似性。3次重复性实验结果经ImagingMaster 2D Elite 510软件分析,发现hBMSCs可以检测到782±65个点,成纤维细胞可以检测到760±57个点,这些蛋白质等电点和相对分子质量分布范围较广,但大多数集中于pH 4～8,相对分子质量15～100 ku区域。对其中稳定表达的差异蛋白质斑点进行切割,用胰蛋白酶消化后进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析,通过UniProtKB/Swiss-PROT和NCBI nonredundant protein databases蛋白数据库搜索,成功地鉴定出29种表达蛋白,其中有17种蛋白在两种细胞中有显著差别地表达,另外12种蛋白在两种细胞中有相同丰度地表达。Western Blot的实验和免疫组织化学实验结果进一步验证了蛋白质组学的分析结果。结论实验首次对hBMSCs和成纤维细胞进行蛋白质组学研究,成功发现了两种细胞的差异表达蛋白,这些蛋白体现了两种细胞在细胞形态、结构和功能上的异同性。这对于研究hBMSCs向成纤维细胞分化以及应用hBMSCs构建组织工程瓣膜具有重要意义。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 第一部分 骨髓间充质干细胞的分离、纯化及细胞的培养和鉴定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二部分 骨髓间充质干细胞和成纤维细胞的蛋白质组学分析
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢
• 附图