论文摘要
本试验的目的是建立猪繁殖与呼吸综合征和猪流感复合RT-PCR诊断方法,直接从病料中检测病毒,并对河南省不同地区送检的病料进行检测。 根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）美洲型标准株（ATCC VR-2332）的ORF6及部分ORF7保守序列、猪流感（SIV）A/Swine/HeNan/703/2001（H3N2）株的NP基因保守序列,设计合成了两对特异引物:PRRSV（P1）5’AAA GCC TCG TGT TGG GTG3’,（P2）5’TGA GGG TGA TGC TGT GAC3’:SIV （SP1）5’GAC CTT ATC TTT CTG GCT CG3’,（SP2） 5’ACA TCT TCT GGT CTG GCA CT3’。分别从PRRSV感染的细胞培养液和SIV感染SPF鸡胚尿囊液中提取病毒总RNA,并利用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）,扩增出大小为426bp和605bp DNA片段,与预期目的DNA片段大小一致,经PCR和酶切鉴定后,亚克隆到pGEM-T载体中测序,经网上序列分析表明,所克隆的PRRSV DNA片段序列和SIV DNA片段序列与参考基因的核苷酸序列同源性分别为99.5%和99.0%;通过优化RT-PCR条件,最终建立了可同时检测PRRSV和SIV的复合RT-PCR诊断方法,该方法能检出10-4倍稀释的SIV尿囊液和10-4倍稀释的PRRSV细胞培养液,约10pg总RNA。应用此方法分别对河南省不同地区送检26头份病死猪的鼻腔分泌物、气管、血液、肺组织等进行检测,结果5头份PRRSV RT-PCR阳性,4头份SIV和PRRSV RT-PCR同时为阳性,其余猪为阴性,健康猪对照样品全部阴性。实验结果表明,PRRSV和SIV复合RT-PCR诊断方法具有高度特异性和敏感性,且节约时间（只需3～5h）等特点。
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