阻断胶质瘤细胞AKT通路对Wnt通路影响的实验研究

论文摘要

脑胶质瘤属常见原发性神经系统肿瘤,多呈浸润性生长,手术不易全切,综合疗效差。在国人全身肿瘤中,恶性胶质瘤5年死亡率仅次于胰腺癌和肺癌,居第三位,5年生存率不足5%。虽然我们对于胶质瘤尝试进行了各种综合治疗,但是效果仍不理想。这是由于肿瘤是一种多因素影响、多基因参与、多阶段形成的复杂疾病。正因为如此,研究其发病机理、探索有效治疗方法一直是神经外科重要课题之一。我们应当认识到胶质瘤的发生发展与其他肿瘤一样,同样是涉及细胞周期调控、发育与分化、信号传导、凋亡与死亡和细胞代谢等等多种机制异常的病理过程。PI3K-Akt信号转导通路作为细胞内重要信号通路之一,通过影响下游多种效应分子的活化状态,在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用,它与人类多种肿瘤的发生发展密切相关。作为此通路的第二信使,P13K的3’磷酸化作用可以使PIP2生成PIP3。P13K是一个脂质激酶,可以被许多不同的信号所激活,包括生长因子和细胞间的相互作用信号等。P13K可以激活高度保守的信号传导通路,通过下游许多蛋白激酶,包括Akt/PKB、P70 S6激酶、PDKs（磷脂酰激酶依赖性激酶）等而影响生物体的许多细胞过程。作为一种丝氨酸-苏氨酸激酶,Akt/PKB可以磷酸化许多底物,参与体内许多重要的细胞代谢信号通路。Wnt信号通路是一条十分保守的信号传导通路,从低等生物（如果蝇）至高等哺乳动物,其成员都具有高度的同源性。Wnt基因属于原癌基因,产物为分泌型糖蛋白,含一段信号肽以及23或24个位置保守的半胱氨酸残基。通常认为,经典的Wnt信号传导通路的组成成分主要包括：配体（Wnnt家族分子）、跨膜受体（Fr izzled家族分子和LRP-5/6）、胞浆调节蛋白（Dsh、APC、Axin、GSK-3β、P-catenin等）以及核内转录因子（TCF/LEF1家族）等。当Wnt分子与跨膜受体结合后,通过受体与Dsh的相互作用以及一系列胞质蛋白的相互作用使P-catenin在胞浆内累积并转位入核,与核内转录因子TCF/LEF1共同作用,激活下游靶基因的转录,引发生物学效应。越来越多的研究结果表明Wnt信号通路不仅在胚胎发育过程中具有至关重要的作用,而且还与众多不同的组织干细胞自我更新和分化,以及多种人类疾病的发生发展密切相关。有文献报道,Akt/PI3K和Wnt信号通路在不同动物或不同器官的细胞增殖、发育及成瘤等多个过程都存在不同程度的相互影响过程。目前尚无通过特异性药物来阻断胶质瘤细胞内PI3K/Akt通路后对Wnt通路进行研究的报道。本研究对胶质瘤中PI3K/Akt对Wnt通路的作用进行了分析。本课题实验分为三部分：第一部分：使用特异性Akt阻断剂LY294002对LN229与U251胶质瘤细胞进行处理,采用Western blot对Akt、p-Akt表达的变化进行验证,并对LY294002的使用浓度进行了梯度实验,寻找最佳抑制浓度。通过流式细胞仪、MTT实验、Transwell体外侵袭实验对胶质瘤细胞周期、增殖、侵袭的影响进行检测。第二部分：设计序列合成siRNA直接对胶质瘤细胞β-catenin表达进行敲低,通过Western blot对Wnt通路成员的蛋白表达变化进行测定,包括：β-catenin、Cyclin D1、Fra-1、c-Myc。将结果与LY294002药物阻断Akt通路进行比对分析。并采用TOP/FOP flash系统来检测TCF的转录表达水平。通过免疫荧光对β-catenin完成细胞定位分析。第三部分：构建LN229裸鼠皮下荷瘤模型,进行LY294002的体内治疗,观察肿瘤生长情况并绘制生长曲线,将肿瘤组织进行免疫组化染色,对前面体外实验部分进行进一步的补充验证。本研究可以得出如下结论：1.LY294002可阻断PI3K/Akt通路,并降低U251和LN229细胞增殖和侵袭能力。2.肿瘤细胞增殖能力的的降低与Wnt/β-catenin通路一些成员表达降低有关,包括Fra-1,c-Myc和Cyclin D1。3.在恶性胶质瘤细胞中Wnt/β-catenin通路受到了PI3K/Akt通路的调节。4.体内成瘤实验表明LY294002可以使LN229异体移植肿瘤的生长速度减慢。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、LY294002对胶质瘤生长的抑制作用
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、阻断PI3K/Akt通路后对Wnt/β-catenin通路相关进行检测
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、LN229细胞裸鼠皮下荷瘤模型的建立及LY294002的治疗体内研究
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 EGFR通路与Wnt通路在肿瘤细胞中的交互作用
• 综述参考文献
• 致谢