家蚕BmNADHb5的表达分析及其亚细胞定位

论文摘要

从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选出一条438 bp的基因序列（基因登录号:EU826676）,编码150个氨基酸残基,序列比对发现是NDUF-b5家族的一个亚基,将该基因命名为BmNADHb5（Bombyx mori Nicotinamide adenine dinucleotide hydridecyto-chrome b5 reductase）。目的片段经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后插入到高效表达载体pET-28a（+）中,成功构建原核表达载体pET-28a（+）-BmNADHb5,在E.coli Rosetta中过度表达重组的pET-28a（+）- BmNADHb5并纯化蛋白。超声破碎表达产物,发现以包涵体的形式存在于沉淀中,我们通过镍柱进行纯化,以纯化的融合蛋白为抗原多次免疫一只雄性新西兰兔,获得的抗体用间接酶联免疫吸附实验（ELISA）测得其效价为1:12800以上。我们提取了家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾四个时期的总蛋白和总RNA,又选择五龄幼虫第三天作为实验对象来研究BmNADHb5的组织分布情况,提取了家蚕的头、表皮、马氏管、气管、脂肪体、丝腺、睾丸和卵巢等组织的总蛋白和总RNA。我们用ELISA半定量法和Western blot以及荧光定量PCR实验检测BmNADHb5的表达分析及其分布。ELISA半定量法和Western blot技术分析发现BmNADHb5蛋白在家蚕各发育时期都有表达,其中卵期表达量明显高于其他发育时期,在各组织中,气管、生殖器等表达量较高。荧光定量PCR实验,我们发现家蚕各发育时期,蛹期表达量明显高于其他发育时期,在各组织中,马氏管表达量最高。我们又用免疫荧光技术对BmNADHb5蛋白在家蚕卵巢上皮细胞BmN进行定位研究,结果发现,它在细胞整个生长周期中主要存在于细胞质中。该结果为我们进一步研究BmNADHb5蛋白在细胞中的功能奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 NADH 还原酶的综述
• 引言
• 1 酶的发现
• 2 氧化还原酶的分类
• 3 线粒体复合体和NADH
• 4 NADH 和NADH 辅酶的化学结构的关系
• 5 NADH-细胞色素b5 还原酶
• 6 NADH 突变引起的疾病
• 7 展望
• 第二章 实验方案设计
• 1 实验目的和意义
• 2 实验流程
• 第三章 生物信息学分析
• 1 生物信息学工具
• 2 结果与分析
• 2.1 基因分析
• 2.1.1 进行序列比对
• 2.2 蛋白性质分析
• 2.2.1 保守结构域分子
• 2.2.2 跨膜结构分析
• 2.2.3 疏水性分析
• 2.2.4 BmNADHb5 蛋白定位的预测
• 2.2.5 信号肽分析
• 2.2.6 功能位点的预测
• 2.2.7 BmNADHb5 类家族蛋白的同源分析
• 2.2.8 进化树分析
• 2.2.9 二级结构预测
• 3 讨论
• 第四章 BmNADHb5 的克隆、表达、纯化及抗体制备
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂的配制
• 1.3.1 培养基
• 1.3.2 碱裂解法提取质粒DNA 用溶液
• 1.3.3 核酸电泳所用溶液
• 1.3.4 SDS-PAGE 用试剂
• 1.3.5 抗体纯化用试剂
• 1.3.6 Bradford 检测用试剂
• 1.3.7 抗体制备用试剂
• 1.3.8 ELISA 试剂
• 1.3.9 其他试剂
• 2 实验方法
• 2.1 BmNADHb5 基因的克隆
• 2.1.1 PCR 获得的ORF 序列
• 2.1.2 PCR 产物与表达载体pET-28a（+）的双酶切
• 2.1.3 酶切产物的纯化
• 2.1.4 连接反应
• 2.1.5 E.coli TG1、E.coli Rosetta 感受态细胞的制备
• 2.1.6 连接产物的转化
• 2.1.7 重组克隆的筛选与鉴定
• 2.1.8 DNA 胶回收
• 2.1.9 质粒提取
• 2.1.10 基因序列的测定
• 2.1.11 Bradford 法蛋白定量
• 2.2 BmNADHb5 重组质粒在大肠杆菌中的表达
• 2.2.1 融合蛋白的诱导表达
• 2.2.2 SDS-PAGE 操作步骤
• 2.2.3 融合蛋白的纯化
• 2.3 抗体的制备
• 2.3.1 抗原的制备
• 2.3.2 免疫动物
• 2.3.3 多克隆抗血清的制备
• 2.3.4 抗体的纯化
• 2.3.5 抗体的效价测定（ELISA）
• 3 结果
• 3.1 PCR 扩增目的片段
• 3.2 重组质粒pET-28a（+）-BmNADHb5 的双酶切鉴定
• 3.3 重组质粒测序结果
• 3.4 蛋白诱导纯化
• 3.5 处理包涵体
• 3.6 抗体纯化图
• 3.7 抗体的效价测定
• 4 讨论
• 第五章 BmNADH 的表达分析及其分布
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂的配制
• 1.3.1 抗体纯化用试剂
• 1.3.2 Western blot 试剂
• 2 方法
• 2.1 Western blot 检测
• 2.2 总蛋白和RNA 的提取及定量
• 2.2.1 总蛋白质的提取及定量
• 2.2.2 总RNA 的提取
• 2.2.3 反转录反应
• 2.3 荧光定量PCR 检测BmNADHb5 在家蚕各组织的分布
• 2.3.1 荧光定量PCR 的引物设计
• 2.3.2 荧光定量PCR
• 2.3.3 荧光定量PCR 数据分析
• 3 实验结果与讨论
• 3.1 抗体的Western blot 分析
• 3.2 ELISA 半定量法和Western blot 检测各组织
• 3.3 ELISA 半定量测定家蚕各时期中BmNADHb5 含量
• 3.4 荧光定量PCR 技术对BmNADHb5 转录水平的分析
• 4 讨论
• 第六章 亚细胞定位
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂的配制
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢