论文题目: 鸡多趾候选基因的SNPs及表达差异研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 动物遗传育种与繁殖
作者: 杜晓惠
导师: 邱祥聘,朱庆,李宁
关键词: 多趾,候选基因,表达
文献来源: 四川农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 多趾存在于少数鸡种中,便于实验操作和观察,是研究肢体发育过程中基因之间相互作用的极好材料。参考人和鼠多趾相关基因间的相互作用以及多趾同源区间,我们将En2、Shh、Lmbr1、Hlxb9和Gli3基因作为鸡多趾研究的候选基因,寻找与多趾有关的SNPs,并检测候选基因表达上的差异,希望揭示候选基因间的相互作用并阐明鸡多趾形成的原因。 SNP搜寻所用实验材料共6组,有丝羽乌骨鸡(五趾)、A系肉鸡(四趾)、四趾菊花鸡、五趾菊花鸡、四趾北京油鸡和五趾北京油鸡。每组选5个个体对候选基因进行PCR后分6组混合回收产物并测序比对,在五个候选基因的外显子、内含子保守区以及Lmbr1的5’上游区寻找能严格区别四趾和五趾表型的SNPs作为趾型相关SNPs。结果显示这五个候选基因的外显子相当保守,只发现Lmbr1外显子16的一处C/T变异和Gli3外显子15的G/A变异,没有造成氨基酸改变,但测序比对或SSCP筛查排除了它们与趾型的关系。在候选基因的内含子保守区我们只发现Lmbr1的内含子5有一处C/A变异与趾型相关,定位在chr2:7901586bp。所有的四趾鸡该位点都为C,所有的五趾鸡该位点都为A/N。对菊花鸡、北京油鸡、CAU资源家系(由A系肉鸡和丝羽乌骨鸡建立)共517个体中进行了SSCP群体分型,证实了这个SNP的确与趾型相关。在Lmbr1 5’上游区段的筛查中,我们从26处变异中筛查出6处趾型相关SNP,并将这6处SNP定位在Chr2:7922655～Chr2:7928742bp之间。 在MatInspector网上预测中,Lmbr1 5’上游的6处SNP中有3处改变了同源异形蛋白因子或胚胎形成有关的蛋白结合位点。Lmbr1内含子5的变异至少改变了3个同源异形蛋白因子的结合位点,为其编码的Hox基因家族在人和鼠多趾的发育与模式形成中起着重要作用。预测结果也支持Lmbr1与趾型有关。 候选基因的表达研究采用白莱航(四趾)和丝羽乌骨鸡(五趾)的纯繁种蛋同批孵化,选择同期发育的胚胎分为头、躯体和肢芽三部分提取RNA。采用RT-PCR法,我们最早在1d(孵化24小时)检测到Gli3、Lmbr1和Shh的表达,早于胚胎原位杂
论文目录:
摘要
Abstract
第一部分 文献综述
一、多趾及其相关基因的研究概况
1 肢体发育概述
1．1 为什么要研究肢体的发育
1．2 肢体发育的轴模式及其信号分子
2 多趾(指)的研究概况
2．1 人类多趾的研究概况
2．2 小鼠多趾的研究概况
2．3 鸡多趾的研究概况
2．4 人、鼠和鸡多趾候选区间比较
3 多趾相关基因及其互作
3．1 shh基因研究进展
3．2 Lmbr1基因研究进展
3．3 Gli3基因
3．4 dHand基因
3．5 Hlxb9/Hb9基因
3．6 En2基因
3．7 Hox基因
4 本研究的内容及目的
二、单核昔酸多态性的研究与应用
1 SNP的基本概念与特点
1．1 SNP的基本概念及分类
1．2 SNP的特点
2 SNP的检测技术
2．1 基于 PCR或酶切的方法
2．2 基于分子杂交的方法
2．3 基于荧光共振能量传递的方法
2．4 基于 DNA构象的方法
2．5 质谱法
2．6 直接测序方法
2．7 生物信息学方法
3 SNP的应用前景及存在的问题
3．1 SNP的应用前景
3．2 SNP存在的问题
三、实时定量 PCR技术的原理与应用
1 实时定量 PCR的发展
2 实时定量 PCR原理
2．1 实时定量 PCR技术中的几个关键概念
2．2 荧光标记
3 实时定量PCR的参照
4 实时定量 PCR方法
4．1 标准曲线法的相对定量
4．2 比较 Ct法的相对定量
4．3 标准曲线法的绝对定量
5 实时定量 PCR的应用
5．1 基因表达的研究
5．2 基因突变及其多态性
5．3 肿瘤研究
5．4 病原体测定
5．5 遗传病的诊断
6 存在的问题及应用前景
第二部分 材料与方法
1 总技术路线
2 主要仪器
3 寻找候选基因的SNP
3．1 实验材料
3．2 试剂及溶液配制
3．3 候选基因序列的获得和所用引物
3．4 实验方法与步骤
4 PCR-SSCP
4．1 实验材料
4．2 所用引物
4．3 试剂及溶液配制
4．4 实验方法与步骤
5 候选基因的表达研究
5．1 实验器材准备
5．2 试剂及溶液配制
5．3 实验材料及其处理
5．4 候选基因表达研究所用引物
5．5 实验方法与步骤
第三部分 结果与讨论
1 候选基因趾型相关 SNPs的确定
1．1 鸡血DNA提取效果
1．2 候选基因外显子趾型相关SNPs
1．3 候选基因内含子保守区趾型相关SNPs
1．4 Lmbrl 5'上游区段趾型相关 SNPs
1．5 小结
2 趾型相关 SNPs的SSCP筛查
2．1 PC12引物的SSCP结果
2．2 PC5引物SSCP结果与讨论
2．3 SNPs转录因子结合位点预测与讨论
2．4 Lmbr1与鸡多趾的关系讨论
2．5 小结
3 候选基因的表达研究
3．1 RNA提取效果
3．2 RT-PCR扩增子测序
3．3 RT-PCR结果
3．4 定量 PCR结果
3．5 Gli3、Lmbr1和 Shh的表达量与多趾讨论
3．6 小结
4 总结
参考文献
致谢
附图
附表
作者简历
发布时间: 2005-10-27
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