抗DR5抗体诱导鼠肝癌细胞凋亡的研究

论文摘要

原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤之一,居我国癌症发病率的第二位,每年约有13万人死于肝癌。近些年来其发病率和死亡率有逐年升高的趋势。由于其具有侵袭性强、易复发、转移等生物学特性,目前包括手术、放疗、化疗等各种治疗方法的效果均不佳,而生物治疗在肝癌综合治疗中的应用取得较大进展,成为肿瘤治疗的第四模式。死亡受体5（DR5/TRAILR2）是TRAILR中的一员,属于肿瘤坏死因子受体超家族。当它与相关配体结合时,能选择性地杀伤多种肿瘤细胞而对正常细胞没有毒性,曾被誉为最有发展前途的抗肿瘤靶点。本文将抗Anti-DR5 mAb体内、外作用于鼠肝癌细胞,并联合应用化疗药物阿霉素（ADM）或放线菌素-D（ACTD）,观察Anti-DR5 mAb与化疗药物对肝癌细胞的协同杀伤作用,以研究探讨Anti-DR5 mAb与化疗药物联合应用于肝癌的治疗作用及机制。我们采用重叠PCR技术获得了DR5基因,构建原核表达载体pET22b（+）/DR5,通过优化其表达条件,实现目的蛋白在大肠杆菌Rosetta-gami中的高效表达。表达产物主要以包函体的形式存在,且表达量占菌体总蛋白的30%以上。用镍亲和层析柱纯化目的蛋白,得到的蛋白纯度均在95%以上。ELISA结果表明所纯化的蛋白可与抗DR5抗体发生特异结合。用纯化的sDR5免疫小鼠,制备Anti-DR5 mAb,应用流式细胞术与细胞毒性试验检测Anti-DR5 mAb、ADM和ACTD诱导肝癌细胞凋亡的作用。建立小鼠肝癌模型,皮下注射Anti-DR5mAb、ADM、ACTD、Anti-DR5 mAb-ADM和Anti-DR5 mAb-ACTD,观察它们对小鼠肿瘤体积与重量增长的抑制、小鼠体重的增加以及对小鼠存活率的影响作用,并通过HE染色和TUNEL实验观察其对肝癌细胞的凋亡作用以及对正常肝细胞是否具有毒性作用。结果表明,Anti-DR5 mAb、ADM和ACTD作用于肝癌细胞后,均可诱导肝癌细胞凋亡,Anti-DR5 mAb、ADM、ACTD、Anti-DR5 mAb-ADM和Anti-DR5mAb-ACTD作用于HCC小鼠后,使小鼠肿瘤重量增加减缓,极大的延长了小鼠的存活时间,HE染色与TUNEL实验也显示Anti-DR5 mAb与ADM/ACTD化疗药物联合应用时,对诱导肝癌细胞凋亡具有协同增效作用,同时,大幅度降低了Anti-DR5 mAb、ADM和ACTD化疗药物对正常肝细胞的毒性。总之,我们通过基因工程技术成功地构建了DR5基因,并在原核表达体系获得高效表达。纯化复性DR5蛋白免疫小鼠,制备了Anti-DR5 mAb。Anti-DR5mAb用于小鼠肝癌的治疗,体内外实验结果显示Anti-DR5 mAb、ADM、ACTD对HCC细胞具有协同杀伤作用,联合应用时对正常肝细胞的毒性小。这种协同杀伤效应是通过诱导细胞凋亡而实现的,其机制可能是由于凋亡链中的正反馈而使凋亡级联放大,亦可能是亚毒性剂量的ADM、ACTD可高效阻断凋亡抑制蛋白或诱骗受体的生成,而使TRAIL诱导的凋亡呈现高效。Anti-DR5 mAb作用肝癌的机制不仅是通过细胞凋亡的途径,还可能与线粒体依赖途径有关,这些为肝癌发病机理的研究及有效治疗提供了新的靶点。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 一、肝癌与细胞凋亡
• 1 肝癌的形成与细胞凋亡
• 2 细胞凋亡的相关基因及作用
• 3 参与细胞凋亡的其他分子
• 4 诱导细胞凋亡的其他分子
• 二、肝癌的生物治疗
• 1 基因治疗
• 2 免疫治疗
• 3 干细胞移植治疗
• 4 抑制血管生成治疗
• 5 抗体靶向治疗
• 三、以死亡受体为靶点的肿瘤生物治疗
• 1 TRAIL/DR5系统抗肿瘤应用的研究
• 2 抗人DR5单克隆抗体的抗肿瘤研究
• 3 以DR3为靶点的肿瘤生物治疗的意义
• 四、阿霉素与放线菌素-D等化疗药物的抗瘤作用
• 1 阿霉素的作用机制
• 2 放线菌素-D的作用机制
• 第二章 实验方案设计
• 一、研究目的和意义
• 二、研究内容
• 第三章 融合蛋白DR5的表达、鉴定
• 一、材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 菌株及质粒
• 1.2 生物信息学工具
• 1.3 主要试剂及耗材
• 1.4 主要仪器及设备
• 1.5 主要溶液的配制
• 2 实验方法
• 2.1 确定DR5的核苷酸序列
• 2.2 DR5核苷酸的分段与合成
• 2.3 重叠PCR组装DR5基因
• 2.4 原核表达质粒pET-22b（+）/DR5的构建与转化
• 2.5 重组子的筛选与序列分析
• 2.6 目的蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化
• 2.7 目的蛋白ELISA鉴定其特异性
• 2.8 目的蛋白MTT法鉴定其活性
• 二 结果与分析
• 1.DR5胞外域编码序列的重组
• 2 菌落PCR的筛选结果
• 3 pET-22b（+）/DR5的双酶切结果
• 4 DR5基因的表达和纯化
• 5 sDR5浓度的确定
• 6 特异性鉴定
• 7 可溶性DR5的生物活性鉴定
• 三 讨论
• 第四章 Anti-DR5单克隆抗体的制备及对鼠肝癌细胞的作用分析
• 一、材料和方法
• 1 材料
• 1.1 实验大鼠
• 1.2 主要试剂及耗材
• 1.3 主要仪器及设备
• 1.4 主要溶液的配制
• 2 方法
• 2.1 抗DR5单克隆抗体的制备
• 2.2 体外单克隆抗体对肝癌细胞的杀伤作用
• 2.3 肿瘤动物模型的建立及分组
• 2.4 肿瘤动物模型的药物治疗
• 2.5 小鼠体重的称量及药物对小鼠存活率的影响观察
• 2.6 各组织器官的获取及肿瘤大小、重量的测量
• 2.7 HE染色、脱水和封片
• 2.8 TUNEL法检测细胞凋亡率
• 2.9 数据处理
• 二、结果与分析
• 1 小鼠的免疫和Anti-DR5 mAb的制备
• 2 Anti-DR5 mAb,AMD and ACTD对HCC肿瘤细胞毒作用
• 3 流式细胞仪对细胞凋亡分析
• 4 肿瘤大小、重量的测量
• 5 各组小鼠体重变化
• 6 小鼠存活率结果
• 7 HE染色
• 8 TUNEL检测
• 三、讨论
• 总结
• 参考文献
• 致谢语