水稻NAC家族逆境相关基因的功能鉴定

论文摘要

水稻是世界范围内最重要的粮食作物之一,提高其品质和产量一直是农业科学技术研究努力的目标。干旱、高盐、极端温度等多种非生物逆境胁迫常常会导致水稻的大规模减产,成为许多地区农业发展的重要制约因素。在自然条件日益恶劣的今天,利用现代分子生物学手段研究抗逆相关基因的功能和调控机制进而提高水稻的抗逆性,是水稻功能基因组研究的重要内容。NAC（NAM,ATAF,CUC）转录因子家族在水稻逆境应答和生长发育进程中扮演着十分重要的角色,分离水稻逆境相关NAC基因并鉴定其生物学功能对于水稻抗逆性改良意义重大。本研究对水稻NAC转录因子家族进行了系统的生物信息学分析,对芯片中受逆境诱导表达的候选基因进行了表达谱验证,并挑选了 24个逆境应答的NAC基因作为候选基因,利用超量表达、RNAi技术和突变体鉴定相结合的方法进行进一步研究。根据超量表达转基因植株的逆境表型筛选结果,我们将SN1基因和水稻miR164的NAC靶基因（OMTN）作为重点研究对象并进行了较为深入的功能分析。主要结果如下:经过同源搜索和隐马尔可夫模型筛选,我们初步发现水稻基因组中有138个位点编码NAC或NAC-like转录因子。基于保守NAC结构域进行系统发生分析,水稻NAC转录因子可以分为5个亚类（Ⅰ-Ⅴ）,其中已报道的与发育相关的成员大多属于第Ⅰ亚类,而与逆境相关的成员大多属于第Ⅲ亚类（命名为SNAC）。模体预测分析结果表明:NAC家族蛋白基于模体结构可分为15类（A-O）,大多数NAC蛋白的保守DNA结合结构域位于蛋白N端,而C端的转录调控域则高度可变。酵母单杂交实验表明:含有不同模体组成的NAC蛋白均具有DNA结合活性。逆境芯片数据显示,相当一部分水稻NAC基因受逆境胁迫诱导表达,我们利用实时定量PCR分析验证了这些基因的逆境表达谱。启动子顺式元件分析结果表明:NAC家族基因启动子区域主要有17个顺式元件富集,其中包括对激素、光和温度等刺激响应的顺式元件以及与组织器官特异表达模式相关的顺式元件等。SN1基因在干旱、高温、高盐、ABA等逆境胁迫条件下表达量显著上升,时空表达特异性不明显。超量表达SN1基因的转基因植株对高温、干旱和MV（甲基紫精）氧化胁迫的抗性增加,而SN1的RNAi抑制表达植株则表现出对高温、甘露醇模拟的干旱胁迫以及MV氧化胁迫的敏感性增强。定量PCR结果表明:大量ROS清除酶类基因在SN1超量表达植株中的表达量显著上升,而在抑制表达植株中的表达量显著下降。DAB染色的结果表明:在正常条件下,超量表达植株与野生型植株中积累的H2O2含量没有明显差异;而在高温胁迫条件下,超量表达植株中积累的H2O2含量显著低于野生型植株中的H2O2。在高温胁迫条件下,SN1超量表达植株中的MDA含量和相对离子渗漏率显著低于对照植株的相应指标。这些结果说明,SN1极有可能通过调控ROS清除酶类基因的表达来调节水稻中的氧化还原状态进而调控水稻对高温的抗性。共表达分析的结果表明有5个在SN1超量表达植株中上调表达的ROS清除酶类基因与SN1之间存在共表达模式。酵母单杂交点对点分析的结果表明,SN1蛋白能够结合到其中3个ROS清除酶类基因（R1、R11和R45）的启动子区域,说明这3个基因可能是SN1直接的下游靶基因。拟南芥miR164的靶基因是5个NAC基因,我们的研究结果表明水稻中有6个NAC基因（OMTN1-OMTN6）可能是水稻miR164的靶基因。RLM-RACE结果证实miR164能介导OMTN1和OMTN2基因mRNA的断裂,断裂位点与拟南芥中的报道相符。OMTN基因对包括干旱在内的多种逆境胁迫均有响应,它们在水稻不同组织器官中的时空表达模式各不相同。OMTN蛋白具有典型NAC转录因子的特征,它们的转录激活区位于蛋白C端。OMTN基因的miR164识别位点在158份水稻微核心种质资源品种中高度保守。在酵母系统中,定点诱变和缺失靶位点均不会影响OMTN蛋白的DNA结合活性;定点诱变不会影响OMTN蛋白的转录激活活性,而缺失靶位点则会使OMTN蛋白丧失转录激活能力,说明靶位点对于OMTN蛋白转录激活能力的维持具有重要作用。超量表达OMTN2、OMTN3、OMTN4和OMTN6的转基因水稻在成株期对干旱的敏感性显著增强,大量逆境应答基因、发育相关基因、调控基因以及代谢相关基因在OMTN2、OMTN3、OMTN4和OMTN6超量表达植株中的表达量发生了显著变化。OMTN4和OMTN6的RNAi抑制表达植株表现出器官融合、叶片扭曲等与miR164超量表达植株类似的发育表型,说明OMTN基因同时参与了水稻对逆境应答和生长发育的调控。

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摘要

Abstract

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1 前言

1.1 研究问题的由来

1.2 文献综述

1.2.1 植物对非生物逆境的应答反应

1.2.2 NAC转录因子研究进展

1.2.3 活性氧类物质（ROS）在非生物逆境应答中的作用

1.2.4 miRNA及其靶基因在非生物逆境应答中的作用

1.3 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 水稻材料和来源

2.2 实验所用菌株、载体和感受态细胞

2.3 候选基因的选择

2.4 载体构建及遗传转化

2.4.1 转化载体的构建

2.4.2 农杆菌介导的水稻稳定遗传转化

2.5 水稻基因组DNA的抽提和T-DNA插入突变体基因型鉴定

2.6 用于建立内源基因表达谱的水稻材料准备

2.7 基因表达分析

2.7.1 RNA的抽提和Northern杂交

2.7.2 反转录和实时荧光定量RT-PCR

2.7.3 全基因组芯片分析

2.8 转基因植株和突变体苗期材料的抗逆表型鉴定

2.8.1 苗期小方盒培养基条件下的逆境表型鉴定

2.8.2 苗期干旱、高盐、高温和低温胁迫表型鉴定

2.9 转基因植株和突变体成株期干旱胁迫表型鉴定

2.10 水稻抗逆性相关生理指标测定

2.10.1 水稻叶片失水速率测定

2.10.2 细胞膜透性检测

2.10.3 丙二醛（MDA）含量测定

2O₂含量'>2.10.4 DAB染色检测H₂O₂含量

2.11 水稻组织ABA含量测定

2.12 组织细胞学实验

2.12.1 GUS染色

2.12.2 石蜡切片

2.13 水稻叶片的透射电镜

2.14 蛋白亚细胞定位分析

2.14.1 水稻原生质体瞬时表达分析

2.14.2 烟草叶片瞬时表达分析

2.15 酵母细胞中的生化分析

2.15.1 酵母快速转化

2.15.2 酵母中转录激活活性分析

2.15.3 酵母单杂交分析

2.15.4 酵母双杂交

2.16 GUS活性的定量测定

2.17 RLM-RACE分析miRNA-RISC切断靶RNA的位点

2.18 OMTN基因miR164靶位点保守性分析

2.19 生物信息学分析

3 结果与分析

3.1 水稻NAC家族的生物信息学分析

3.1.1 水稻NAC蛋白的系统发生分析

3.1.2 水稻NAC蛋白的模体预测分析

3.1.3 水稻NAC蛋白的DNA结合活性分析

3.2 水稻NAC家族基因的表达分析

3.2.1 水稻NAC家族基因的启动子顺式调控元件分析

3.2.2 水稻NAC家族基因的逆境表达谱分析

3.3 候选基因的载体构建、遗传转化和检测以及突变体材料的获得

3.3.1 候选基因的载体构建和遗传转化

3.3.2 突变体材料的获得和基因型鉴定

3.3.3 转基因材料和突变体材料的分子鉴定

3.4 转基因材料和突变体材料的逆境表型初步筛选

3.5 SN1基因的功能研究

3.5.1 SN1基因的序列分析

3.5.2 SN1基因的表达模式分析

3.5.3 SN1相关遗传转化材料和突变体材料的获得和分子鉴定

3.5.4 SN1超量表达转基因植株逆境表型分析

3.5.5 SN1 RNAi抑制表达转基因植株的逆境表型分析

3.5.6 SN1超量表达和抑制表达转基因植株中基因表达变化分析

3.5.7 SN1参与ROS代谢调控

3.5.8 SN1能结合下游特定ROS基因的启动子

3.5.9 SN1蛋白的亚细胞定位分析

3.5.10 SN1与ABA信号转导

3.5.11 SN1互作蛋白筛选

3.6 水稻miR164靶标NAC基因（OMTN）的功能研究

3.6.1 植物中成熟miR164序列分析

3.6.2 水稻中miR164靶基因的预测

3.6.3 OMTN基因的序列分析

3.6.4 OMTN基因的逆境表达谱

3.6.5 OMTN基因的时空表达模式

3.6.6 OMTN蛋白转录因子基本特征鉴定

3.6.7 OMTN的miR164靶位点的进化保守性分析

3.6.8 OMTN的miR164靶位点的功能分析

3.6.9 OMTN超量表达转基因植株成株期对干旱胁迫敏感性增强

3.6.10 OMTN超量表达转基因植株全基因组芯片分析

3.6.11 OMTN RNAi抑制表达转基因植株对水稻生长发育的影响

4 讨论

4.1 SN1基因功能的探讨

4.1.1 SN1通过调控下游ROS基因的表达来提高水稻对高温的抗性

4.1.2 SN1的靶基因及其在逆境应答中可能发挥的功能

4.1.3 SN1通过不同的途径参与对干旱和高温的调控

4.1.4 SN1介导的非生物逆境应答过程不依赖于ABA途径

4.2 OMTN基因功能探讨

4.2.1 水稻与拟南芥miR164靶基因的比较

4.2.2 OMTN参与水稻的逆境应答和生长发育调控过程

4.2.3 OMTN中miR164识别靶位点在进化中高度保守的生物学意义

4.2.4 miR164及OMTN在水稻抗逆性改良方面的应用前景

4.3 关于利用NAC基因进行抗逆改良

4.3.1 利用多基因聚合策略取代单基因改良策略

4.3.2 选择合适的启动子

4.3.3 寻找有利的自然变异

4.4 后续工作设想

参考文献

附录

附录Ⅰ 引物列表

附录Ⅱ 部分实验的详细操作程序

附录Ⅲ 作者简介

致谢

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