论文摘要
杏花雨注射液是新研制的银杏叶提取物注射液,其黄酮苷含量为49.79%,萜烯为4.4%。已有许多文献报道黄酮类化合物有较好的抗肿瘤活性,杏花雨注射液作为银杏叶提取物其中含有丰富的黄酮类物质,居各类物质含量之首。因此,其在抗肿瘤方面可能具有很大潜力。本实验旨在研究杏花雨注射液对小鼠肝癌H22细胞增殖的影响,并进一步探讨其作用机理,从而为其更好的应用于临床提供客观而科学的依据。1杏花雨注射液的体外抗肿瘤作用体外MTT实验结果表明,用杏花雨注射液22、44、88、175、350 mg·L-1的浓度处理H22细胞3 d,对肿瘤细胞增殖抑制率分别为（1.54±0.25）%,（13.55±0.89）%,（32.67±2.69）%,（81.05±0.5）%,（90.18±2.63）%,与对照组相比该药能明显抑制H22细胞的增殖（P<0.05）,其IC50值为（113.53±6.49） mg·L-1,并呈现明显的浓度效应关系。台盼蓝排斥法观察杏花雨注射液对H22细胞的生长曲线的影响,同样发现杏花雨注射液对H22细胞的生长有明显的抑制作用,也呈现明显的浓度效应关系。说明杏花雨注射液在体外有明显的抗肿瘤活性。2杏花雨注射液对肿瘤细胞周期的影响采用流式细胞仪分析了杏花雨注射液对H22细胞周期移行的影响。经不同浓度的杏花雨注射液(22～350 mg·L-1)作用细胞24小时后,S期细胞的比例显著下降, G2期细胞的比例明显增加,且G2期细胞具有明显的浓度效应关系,说明杏花雨注射液将H22细胞分裂阻滞于G2/M期,最终导致细胞死亡。3杏花雨注射液诱导肿瘤细胞的凋亡用Giemsa染色、AO/EB荧光染色方法分别观察了不同浓度杏花雨注射液(22～350 mg·L-1)作用于H22细胞24小时后的形态变化。Giemsa染色将H22细胞核染成蓝紫色,胞浆染成粉红色。未加药组的细胞核染色均一、结构完整;给药组细胞呈现核聚集和碎裂。AO/EB双荧光染色法观察,既有细胞核染橘红色,呈致密斑块或碎片状晚期凋亡细胞和核膜完整,染色质染均匀的红色坏死细胞。并且随着杏花雨注射液浓度的变化愈来愈明显,表明凋亡细胞的比例逐渐增加。DNA凝胶电泳实验中,杏花雨注射液作用H22细胞24小时后,提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳,呈现典型的“DNA梯型条带”（DNA ladder）。流式细胞仪进行细胞的DNA含量测定,可见经不同浓度的杏花雨注射液(22～350 mg·L-1)作用H22细胞24小时后,出现一个“G1亚峰”,且凋亡细胞的比例随着杏花雨注射液浓度的升高而增加,呈一定的剂量依赖性。从以上三方面的结果可以认为杏花雨注射液能够诱导肿瘤细胞的凋亡。4杏花雨注射液对凋亡相关基因p53、Bcl-2蛋白表达的影响本文观察了杏花雨注射液对凋亡相关基因p53、Bcl-2蛋白表达的影响。经不同浓度的杏花雨注射液(22～350 mg·L-1)作用H22细胞24小时后,western-blot结果显示杏花雨注射液可使Bcl-2蛋白的表达量降低,且呈一定的剂量依赖性,同时增加p53蛋白的表达。综上所述,杏花雨注射液在体外能显著的抑止肿瘤细胞的生长,并且将其阻断在G2/M期,并通过依赖p53途径,下调抑制凋亡基因Bcl-2的蛋白表达,从而诱导肿瘤细胞凋亡。