具有甾体羟化功能的植物内生菌的筛选及其转化产物的研究

论文摘要

鉴于甾体药物日益广泛和重要的应用，以及生物转化在甾体药物领域的重要性，本项目以植物内生菌为主进行了转化甾体4AD的菌种筛选和转化条件研究，以获得具有产业化价值的转化菌种和工艺。 通过筛选，从500余株植物内生真菌中筛选出了对4AD具有转化能力的71株菌株。从其中14株的4AD转化产物中分离得到17种不同的转化产物，并逐一进行了产物鉴定；其中11α-OH-17-oxo-homo-AD的产生未见有微生物转化产生的报道。对其余转化菌的产物与已知产物进行了对照识别；并对有转化活性的部分真菌进行了菌种分类学研究，确定了28株真菌的基本归属。其中白僵菌的转化产物6β．11α-OH-TS、11α-OH-17-oxo-homo-AD在该菌的转化中未见报道。节葡萄孢霉属、双孢霉属、蚀丝霉属等转化4AD产生11α-OH-17-oxo-homo-AD，17-oxo-homo-ADD，11α，15α-OH-AD等均未发现有文献报道。 对具有现实应用价值的11羟化菌株HCCB00304进行了转化条件的优化，通过培养基、培养条件等的改变，使底物加量1％时11-OH-AD、11-OH-ADD的转化率达到90％，具有产业化价值；底物加量2％时转化率高于70％。并进行了中试放大，获得成功；其产品已作为重要中间体提供合成部门，完成了一系列甾体药物的合成。 对菌株HCCB00304的羟化机制进行了初步研究。从转化周期参数、转化的诱导和抑制等方面进行了考察。证实了羟化酶可被一些诱导剂如脱氧胆酸等诱导；可被一些抑制剂如甲吡酮等抑制；并对诱导、抑制剂量和方式进行了考察，为产业化提供了直接的指导。通过参数统计和中间产物分析确定了可能的羟化模式，为更好地理解加氧机制提供了依据。 尝试利用分子生物学和蛋白组学手段对HCCB00304的氧化酶进行研究。虽然未能直接获得该酶的基因和序列，但研究结果表明了底物的加入对整体代谢的影响。在对表达差异显著的15个点进行了鉴定后，确定了其中5个属于糖酵解过程的关键酶，说明底物不仅诱导了直接作用于底物的氧化酶的表达而且导致了代谢的整体迁移。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1.甾体药物
• 1.2.甾体的微生物转化
• 1.2.1.边链的裂解反应
• 1.2.2.羟基化反应
• 1.3.微生物羟化反应的新发展
• 1.3.1.羟化应用技术的发展
• 1.3.2.羟化反应的分子生物学研究进展
• 1.4.本研究的目的意义
• 第2章 植物内生菌转化4AD的多样性筛选
• 2.1.材料与方法
• 2.1.1.材料
• 2.1.2.方法
• 2.2.结果与讨论
• 2.3.本章小结
• 第3章 内生菌转化产物的鉴定
• 3.1.材料与方法
• 3.1.1.材料
• 3.1.2.方法
• 3.2.结果和讨论
• 3.2.1.转化产物的结构鉴定
• 3.2.2.HPLC系统下的已知转化产物图谱
• 3.3.本章小结
• 第4章 具有转化活性的部分内生菌株的鉴定
• 4.1.材料与方法
• 4.1.1.材料
• 4.1.2.方法
• 4.2.结果和讨论
• 4.3.本章小结
• 第5章 11位羟化菌株HCCB00304的条件优化及其转化机制的研究
• 第1节 菌株HCCB00304的条件优化
• 5.1.1.材料和方法
• 5.1.1.1 试验材料
• 5.1.1.2 试验方法
• 5.1.2.结果与讨论
• 5.1.2.1.不同底物的转化试验
• 5.1.2.2.菌株HCCB00304转化产生11位羟化物的条件优化
• 5.1.2.2.1.培养基的优化
• 5.1.2.2.2.培养条件的优化
• 5.1.2.3.11羟化产物的产业化应用
• 第2节 HCCB00304转化机制的研究
• 5.2.1.材料和方法
• 5.2.2.1.试验材料
• 5.2.2.2.试验方法
• 5.2.2.结果和讨论
• 5.2.2.1.转化周期的考察
• 5.2.2.2.转化过程的诱导和抑制
• 5.2.2.2.1.诱导与否对转化的影响
• 5.2.2.2.2.不同诱导剂对转化的诱导
• 5.2.2.2.2.抑制剂对转化的影响
• 5.2.3.本节小结
• 第3节 HCCB00304的分子生物学研究
• 5.3.1.材料与方法
• 5.3.1.1.材料
• 5.3.1.2.方法
• 5.3.2.结果和讨论
• 5.3.2.1.氧化酶的分子生物学试验
• 5.3.2.2.HCCB00304的蛋白表达差异的研究
• 5.3.3.本节小结
• 全文总结
• 创新点
• 进一步工作设想
• 参考文献
• 发表文章目录
• 致谢
• 附页：转化产物的部分图谱