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拟南芥SOS信号转导途径基因对小麦的转化

2020-12-01阅读(416)

拟南芥SOS信号转导途径基因对小麦的转化

论文摘要

小麦是世界上分布最广、种植面积最大的粮食作物,种植总面积和总产量均为各种粮食之首。土壤盐渍化严重影响了农作物的产量和农业生产的发展,对植物尤其是农作物进行耐盐、耐旱的改良势在必行。传统的遗传育种难以打破种间隔离的限制,植物的基因工程技术主要包括转基因技术解决了这一问题。SOS信号途径对植物的耐盐性至关重要,本论文采用一种新的小麦基因转化方法-农杆菌介导的小麦生长点转化法,把SOS基因进行串联,首次把拟南芥的SOS基因转入小麦,各种分子实验证据证明SOS基因已经整合进小麦基因组并得到稳定遗传和表达。论文分析了SOS基因在SOS信号途径中的作用方式,SOS信号途径在小麦耐盐中的作用和小麦内源基因TaSOS1在SOS转基因植株中的表达。1.实验采用农杆菌介导的小麦生长点转化法对五种基因型小麦进行转化。生长点转化法简单,高效,稳定,对实验设备要求低,克服了基因枪等转化方法多拷贝插入,转化效率低等缺点,农杆菌介导的转化多为单拷贝单位点插入,有利于转基因的表达和稳定遗传,在此基础上,进一步简化了试验程序,不需要长时间的组织培养,缩短了实验周期,并大大提高了转化率。2.用100mg/L的潮霉素和0.2mg/L（0.1%）的Basta分别对SOS基因转化植株进行筛选,筛选两周后和对照植株对比明显,筛选后成活的植株通过PCR,Southern杂交进一步验证,发现小麦生长点的转化频率与受体的基因型相关,转化率从高到低依次是济麦21,烟麦,高肥。基因型与转化率有关主要是因为不同基因型的小麦对农杆菌抗侵染能力不同。各种分子实验结果证明拟南芥的SOS基因已经整合进小麦基因组中,RT-PCR结果证明外源基因已稳定遗传并表达。3.对转基因后代进行了遗传和耐盐分析。1)对T2代SOS2-SOS3转化小麦进行了统计分析,结果表明转化植株T2代的分离比大约是3:1,基本符合孟德尔遗传规律。2)分析转基因后代种子萌发率,发现正常条件下转基因后代与对照的种子发芽率相当,盐胁迫下SOS1转基因后代和对照种子差别不大,但SOS2-SOS3和SOS1-SOS2-SOS3转基因后代种子的发芽率要明显高于对照种子的发芽率。3)分析不同盐浓度处理两周后,SOS转基因小麦和对照植株干鲜重,发现在OmMNaCl下,对照和转基因植株生长状况差别不大,随着盐浓度的增加,对照和转基因植株生长量都有所减少,SOS1转化植株在低浓度下比对照稍好,高浓度下和对照差别不大,而SOS2-SOS3和SOS1-SOS2-SOS3转化植株在盐胁迫下生长状况明显好于对照。转基因株系和对照植株NaCl处理后根中和叶中的Na+、K+含量测定结果显示,SOS2-SOS3和SOS1-SOS2-SOS3转化植株的Na+低于SOS1转化植株和对照植株,K+/Na+比高于SOS1转化植株和对照植株。4)盐处理后对植株MDA含量和过氧化氢酶活性进行测定,发现盐处理两周后植株MDA含量都有所上升,但是SOS2-SOS3转基因植株MDA含量得增加少于对照和SOS1转基因植株。200mM NaCl处理24h后,转基因植株和对照植株过氧化氢酶活性变化不明显,处理48h后,SOS2-SOS3转基因植株过氧化氢酶活性明显增强,SOS1转基因植株酶活性也有所增强,但是低于SOS2-SOS3转基因植株。5)RT-PCR对小麦TaSOS1表达分析的结果表明,与对照植株和SOS1转基因植株相比,SOS2-SOS3转化植株中的TaSOS1表达量增强,推测蛋白复合体SOS2-SOS3可能磷酸化并激活了小麦质膜上的Na+/H+逆向转运蛋白TaSOS1,从而增强了转基因植株的耐盐性。以上结果证明了SOS信号途径在单子叶植物小麦耐盐中的起作用,并进一步证明SOS信号途径中,Na+/B+逆向转运蛋白SOS1的作用依赖于SOS2—SOS3蛋白复合体的调节,RT-PCR分析小麦TaSOS1表达的结果表明SOS2—SOS3蛋白复合体可能调节小麦转运蛋白TaSOS1的活性,参与了小麦其它的耐盐信号途径。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 符号说明
  • 第一部分 文献综述
  • 一 小麦遗传转化研究进展
  • 1.1 小麦基因转化方法
  • 1.1.1 PEG介导法
  • 1.1.2 激光微束法
  • 1.1.3 电击法
  • 1.1.4 基因枪法
  • 1.1.5 花粉管通道法
  • 1.1.6 农杆菌介导法
  • 1.2 转基因阳性小麦的筛选和检测方法
  • 1.3 外源基因的表达分析方法
  • 1.3.1 RT-PCR分析
  • 1.3.2 Northern blotting分析
  • 1.3.3 表达蛋白分析
  • 二 植物盐害和耐盐机理研究进展
  • 2.1 植物盐害机理
  • 2.1.1 渗透胁迫
  • 2.1.2 离子胁迫
  • 2.1.3 盐分积累
  • 2.1.4 氧化胁迫
  • 2.2 植物耐盐机理
  • 2.2.1 离子平衡的重建
  • 2.2.2 渗透平衡调节
  • 2.2.3 活性氧（ROS）在细胞内的清除机制
  • 三 植物盐胁迫应答的分子机制研究进展
  • 3.1 植物盐胁迫相关的信号转导途径
  • 3.1.1 SOS信号途径
  • 3.1.2 MAPK渗透/氧化胁迫信号转导途径
  • 3.1.3 ABA相关的信号转导途径
  • +/H+逆向转运蛋白研究'>3.2 植物Na+/H+逆向转运蛋白研究
  • +/H+逆向转运蛋白'>3.2.1 质膜Na+/H+逆向转运蛋白
  • +/H+逆向转运蛋白'>3.2.2 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白
  • 第二部分 材料和方法
  • 一 实验材料及转化所用的菌株,目的基因和质粒载体结构
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 转化所用的菌株,目的基因和质粒载体结构
  • 二 农杆菌转化
  • 2.1 菌液的制各
  • 2.2 小麦生长点转化
  • 三 转基因植株的筛选及鉴定
  • 3.1 转基因植株的筛选
  • 3.2 PCR鉴定
  • 3.2.1 DNA的提取
  • 3.2.2 PCR引物
  • 3.2.3 扩增体系
  • 3.2.4 扩增程序
  • 3.2.5 电泳
  • 3.3 Southern杂交鉴定
  • 3.3.1 质粒酶切及探针片段的回收
  • 3.3.2 DNA提取
  • 3.3.3 基因组DNA的酶切和电泳
  • 3.3.4 转膜
  • 3.3.5 探针标记
  • 3.3.6 杂交及检测
  • 3.4 RT-PCR分析
  • 3.4.1 Trizol法提取叶片总RNA
  • 3.4.2 总RNA的纯化
  • 3.4.3 RT-PCR的体系和程序
  • 四 转基因小麦后代遗传与生化分析
  • 4.1 T2代遗传分析
  • 4.2 后代种子盐胁迫下萌发率分析
  • 4.3 后代盐胁迫下生长量分析
  • +,K+分析'>4.4 后代盐胁迫下Na+,K+分析
  • 4.5 后代盐胁迫下MDA分析
  • 4.6 后代盐胁迫下过氧化氢酶分析
  • 第三部分 结果与分析
  • 一 转基因植株PCR鉴定和转化频率
  • 1.1 转化植株相应抗生素或除草剂的筛选
  • 1.2 PCR分析结果
  • 1.3 转化频率分析结果
  • 二 转基因植株的Southern杂交结果分析
  • 三 转基因植株的T2代遗传分析
  • 四 转基因植株的RT-PCR分析
  • 4.1 总RNA提取结果
  • 4.2 SOS基因在转基因植株中的表达
  • 4.3 SOS1基因在转基因植株叶、根中的表达分析
  • 4.4 小麦中的SOS1同源基因在不同的SOS转化植株中的表达分析
  • 五 转基因植株后代耐盐性分析结果
  • 5.1 转基因后代的萌发率分析
  • 5.2 转基因后代的生长量分析结果
  • +,K+含量分析结果'>5.3 转基因后代的Na+,K+含量分析结果
  • 5.4 转基因后代的MDA分析结果
  • 5.5 转基因后代的过氧化氢酶分析结果
  • 六 转基因后代的田间释放
  • 第四部分 讨论
  • 一 小麦基因转方法
  • 二 转基因小麦的筛选和检测
  • 三 SOS信号途径在小麦中的作用
  • +/H+逆向转运蛋白'>四 小麦质膜Na+/H+逆向转运蛋白
  • 参考文献
  • 致谢
  • 学位论文评阅及答辩情况表

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