论文摘要
背景糖尿病膀胱病变是糖尿病最常见的合并症之一,其发病机制尚不清楚,临床缺乏有效的诊断方法和治疗措施。内皮型一氧化氮合酶（eNOS）在正常生理状态下产生的一氧化氮（NO）能够扩张血管,调节血压,改变局部血流,抑制血小板聚集和抗平滑肌增殖。而在糖尿病肾病、视网膜病和糖尿病神经病等糖尿病并发症中,eNOS基因和蛋白表达出现异常调节,NO生物活性下降,导致微血管内皮细胞损伤和功能失调。eNOS基因和蛋白表达异常与糖尿病膀胱病变的发生发展可能有关。目的建立糖尿病膀胱病变的大鼠模型,对糖尿病膀胱病变进行尿流动力学指标的评估,检测膀胱组织中eNOS mRNA和蛋白两个层面的表达水平,确定eNOS在膀胱中的活化状态及其作用;明确膀胱微血管的超微组织学改变和氧化应激水平,探讨抗氧化治疗能否逆转糖尿病膀胱病变及其可能的作用机理。方法1、通过向雄性SD大鼠腹腔内注射STZ的方法构建糖尿病大鼠模型;设置正常对照组、多尿对照组和糖尿病组,于诱导糖尿病后第6W和第12W进行相关检查。通过尿流动力学指标对膀胱功能进行评价;应用RT-PCR和Western blot方法检测膀胱组织中eNOS mRNA和蛋白两个层面的表达水平,确定其与膀胱功能的相关性;应用免疫组织化学方法检测膀胱中eNOS表达方式与强度。采用电镜技术明确膀胱微血管超微组织学结构的改变;2、设置正常对照组、单纯糖尿病组,糖尿病+L-NIO组和糖尿病+BH4组,通过应用eNOS特异性抑制剂L-NIO和补充eNOS关键辅酶BH4,采用Westernblot方法检测药物作用前后糖尿病大鼠膀胱组织中eNOS下游产物3-NT的含量,明确eNOS在膀胱中的活化状态;3、设置正常对照组、糖尿病+生理盐水组和糖尿病+α-硫辛酸组,应用RT-PCR和Western blot方法检测药物作用前后膀胱组织中eNOS mRNA和蛋白表达水平,采用生化检测技术明确氧化应激状态,探讨抗氧化治疗对糖尿病膀胱病变的作用及其机理。结果1、与正常和多尿对照组相比,糖尿病组大鼠血糖水平显著升高,体重显著下降（P＜0.01）;与正常对照组相比,糖尿病组和多尿对照组大鼠的每日尿量明显增加（P＜0.01）;尿流动力学检查结果显示,6W时正常对照组、多尿对照组和糖尿病组大鼠膀胱容量分别为0.75±0.04,1.62±0.15和2.29±0.16ml,而12W时则为0.86±0.06,1.93±0.10和2.65±0.26ml,各组间差异有显著性;6W时各组大鼠残余尿量分别为0.064±0.003,0.112±0.013和0.232±0.010ml,而至12W时分别为0.071±0.004,0.129±0.024和0.561±0.061ml,各组间差异有显著性;6W时各组大鼠单次排尿量分别为0.70±0.02,1.52±0.30和2.06±0.25ml,而12W时分别为0.80±0.04,1.77±0.11和2.09±0.2lml,各组间差异有显著性;6W时各组大鼠排尿率分别为93.3±2.1%,93.2±2.7%和90.0±2.5%,而至12W时分别为93.1±2.2%,93.8±3.2%和78.1±2.6%,各组间差异有显著性;各组大鼠间最大膀胱内压力差异无显著性（P＜0.05）。糖尿病大鼠的膀胱压力曲线出现多次小的压力波动,曲线不规则。RT-PCR结果显示,6W时各组大鼠膀胱组织中eNOS mRNA表达强度分别为0.81±0.12,0.90±0.12,和1.98±0.16,而至12W时则分别为0.87±0.17,1.05±0.11和2.89±0.23,各组间比较差异有显著性（P＜0.01）。Western blot结果显示,6W时各组大鼠膀胱组织中eNOS蛋白表达强度分别为0.98±0.12,0.93±0.14,和2.28±0.16,而至12W时分别为1.03±0.13,1.14±0.11和3.12±0.20,各组间比较差异有显著性（P＜0.01）。免疫组化结果显示eNOS在膀胱中主要表达于血管内皮,其他组织未见明显表达。与正常对照大鼠相比,6W和12W时糖尿病大鼠膀胱eNOS表达强度明显增强。糖尿病膀胱微血管的电镜表现为血管内皮细胞肿胀,胞质内线粒体嵴缺失,细胞核边缘皱褶,异染色质边集,核膜间隙增宽、不均一。血管基底膜出现溶解,模糊,血管周围胶原沉积。后期出现溶酶体,核糖体和内质网减少。2、RT-PCR与Western blot结果显示糖尿病组大鼠膀胱中的eNOS mRNA和蛋白表达强度高于正常大鼠,而L-NIO和BH4腹腔注射对eNOS mRNA和蛋白表达程度无明显影响。Western blot结果显示3-NT蛋白在糖尿病大鼠膀胱中的表达显著高于正常组（0.39±0.05 vs 0.05±0.01,P＜0.01）,而L-NIO和BH4均显著降低3-NT蛋白含量（0.25±0.05和0.21±0.02,P＜0.01）。3、α-LA对糖尿病大鼠的血糖水平和体重均无影响。与DM+NS组相比,DM+α-LA组大鼠的膀胱容量显著缩小（2.65±0.15 vs 1.93±0.09 ml,P＜0.05）,单次排尿量明显减少（2.09±0.10 vs 1.73±0.06,P＜0.05）,残余尿量显著减少（0.561±0.060vs 0.202±0.013ml,P＜0.01）,但是膀胱排尿率显著提高（78.1±2.6%vs 89.6±2.6%,P＜0.05）。与正常对照组相比,DM+NS组膀胱中氧化应激明显增加,表现为MDA含量增加（0.64±0.05 vs 0.31±0.03 nmol/毫克蛋白,P＜0.01）,SOD活性下降（35.70±2.05 vs 15.23±1.17微克蛋白,P＜0.01）,CAT活性降低（83.45±8.48 vs29.86±4.97微克蛋白,P＜0.01）;而α-LA治疗则使MDA含量下降（0.47±0.05 nmol/毫克蛋白）,SOD和CAT活性增加（27.91±2.09和48.50±3.75微克蛋白）,（P＜0.01）。同时,α-LA治疗显著降低膀胱中eNOS mRNA和蛋白的表达水平（3.01±0.27 vs1.85±0.28和3.89±0.33 vs 2.75±0.24,P＜0.05）,降低3-NT蛋白表达（0.61±0.07 vs0.31±0.05,P＜0.01）。结论1、STZ-糖尿病大鼠的膀胱功能失调表现与人类相似,可以作为糖尿病膀胱病研究的可靠的动物模型。2、糖尿病大鼠膀胱组织中eNOS在mRNA和蛋白两个层面上的表达水平均明显上调,且呈时间依赖性进展。3、糖尿病大鼠的膀胱功能失调随着病程的进展而进行性加重,与eNOS表达强度呈负相关,可以作为膀胱功能的评价指标。4、糖尿病大鼠膀胱的微血管损伤随着病程的进展而进行性加重,与膀胱功能失调程度相一致,与eNOS表达强度呈负相关。可以作为糖尿病膀胱病的形态学评价和诊断指标。5、糖尿病大鼠膀胱组织中eNOS处于脱耦联状态,是膀胱组织中一个重要的超氧化物来源。6、糖尿病膀胱组织中氧化和抗氧化系统失平衡,导致氧化应激。7、抗氧化治疗通过恢复氧化与抗氧化系统之间的平衡,下调eNOS基因和蛋白表达,改善膀胱功能,是治疗糖尿病膀胱病变的一个有效途径。