论文摘要
第一部分大鼠原位肝移植模型及肝移植急性排斥反应模型的建立目的:建立大鼠原位肝移植模型及稳定的近交系大鼠肝移植急性排斥反应模型。方法:采用改良Kamada’s“二袖套法”建立大鼠肝移植模型。预实验采用封闭群SD大鼠,共实施大鼠肝移植120例,其中定型手术80例。在此基础上,建立30例DA到Lewis近交系大鼠肝移植急性排斥反应模型,根据Banff分级评分方案来评价排斥反应的强度。结果:后期40例定型手术中:无肝期为17.98±3.03 min,手术成功率为87.50%,1W存活率为82.5%,手术效果较前期40例明显改善（P<0.05）,差异均有统计学意义。急性排斥反应出现于术后第3d,以术后第7d最为典型。结论:采用改良Kamada’s“二袖套法”,改进肝上下腔静脉重建及肝脏灌注方法,成功建立大鼠原位肝移植模型。近交系大鼠DA→Lewis之间的原位肝移植是稳定的肝移植急性排斥反应模型。第二部分重组腺病毒载体Ad-hIL-10的构建及包装目的:制备携带人白细胞介素10基因的腺病毒载体Ad-hIL-10。方法:设计及合成适当的引物,从pCDNA3.1-hIL-10质粒上PCR扩增得到hIL-10基因,并将其重组到质粒pShuttle-CMV。将重组质粒pShuttle-CMV-hIL-10与pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183细胞,产生重组腺病毒质粒Ad-hIL-10。再将重组腺病毒病毒质粒转染AD-293细胞后包装出腺病毒颗粒,并进行病毒感染滴度的测定。结果:从pCDNA3.1-hIL-10质粒中成功扩增得到hIL-10基因片段,再把hIL-10基因重组到pShuttle-CMV载体中,酶切电泳鉴定及测序鉴定pShuttle-CMV-hIL-10质粒正确;重组腺病毒质粒酶切鉴定为阳性克隆;并获得了高滴度(2×1010IU/ml)、高纯度的腺病毒颗粒。结论:成功构建了含携带有人白细胞介素10基因高纯度、高滴度的重组腺病毒Ad-hIL-10。第三部分Ad-hIL-10对移植肝缺血再灌注损伤的保护作用目的:研究重组腺病毒载体Ad-hIL-10对大鼠移植肝IRI的保护作用及其机制。方法:供受体均选用雄性SD大鼠。供体在0～4℃的乳酸林格氏液中保存12h,采用改良的Kamada’s“二袖套法”建立肝移植模型。实验动物随机分成4个组,各组6对。A组为假手术组,B,C及D组在获取供肝前48h供体分别经肠系膜静脉推注2ml生理盐水、空载体或1.0×1010IU/ml的Ad-hIL-10载体。移植术后24h检测血清ALT,AST水平;肝组织行HE染色,观察病理组织学改变及进行评分（根据Suzuki’s标准）;TUNEL法检测肝细胞凋亡;RT-PCR检测肝组织TNF-α,MIP-2,ICAM-1及hIL-10 mRNA的水平;Werstern blotting测定Bcl-2,Bcl-xl,HO-1及NF-κB蛋白的表达。结果:大鼠移植肝冷保存12h,恢复血流再灌注24h后,与D组比较,B和C组血清ALT,AST升高（P<0.05）;病理学半定量评分（根据Suzuki’s标准）升高（P<0.05）;细胞调亡指数升高（P<0.05）;移植肝中TNF-α,IFN-γ及MIP-2 mRNA显著增高（P<0.05）,差异均有显著性。A、B及C组移植肝不表达hIL-10 mRNA,而D组表达明确。Western blotting检测结果A组大鼠肝脏仅表达少量Bcl-2,Bcl-xl,HO-1及NF-κB蛋白;与D组比较,B组及C组Bcl-2,Bcl-xl及HO-1蛋白表达弱（P<0.05）,而NF-κB蛋白表达明显增强（P<0.05）,差异均有显著性。结论:（1）Ad-hIL-10通过下调前炎性因子TNF-α,MIP-2及ICAM-1mRNA的水平及抗细胞凋亡作用,减轻了移植肝IRI。（2）Ad-hIL-10对前炎性因子TNF-α,MIP-2及ICAM-1 mRNA的下调作用,至少部分是通过大量表达hIL-10抑制NF-κB这一途径来实现的。（3）Ad-hIL-10可以抑制移植肝IRI中细胞调亡,可能与其上调抗调亡基因Bcl-2及Bcl-xl的表达有关。（4）在Ad-hIL-10对移植肝细胞保护及抗凋亡作用中,HO-1为其所转导的hIL-10下游的效应器之一。第四部分Ad-hIL-10对大鼠肝移植后急性排斥发应的影响目的:研究重组腺病毒载体Ad-hIL-10对肝移植后急性排斥反应的抑制作用及探讨其相关机制。方法:供体选用雄性DA大鼠,受体选用Lewis大鼠。采用改良Kamada’s“二袖套法”建立肝移植模型。实验动物随机分成6个组:A组为假手术组（n=6）;B组为对照组（n=12）;C组为空载体组（n=12）,夹闭移植肝肝上及肝下下腔静脉,经门静脉灌注2ml、肝动脉灌注1ml空载体,保存60min;D组为环孢素组（n=12）,手术当天肌注CSA10mg/kg;E组为Ad-hIL-10组（n=12）,夹闭移植肝肝上及肝下下腔静脉,经门静脉灌注2ml、肝动脉灌注1ml 1.0×1010IU/ml的Ad-hIL-10载体,保存60min;F组为Ad-hIL-10+CSA组（n=12）,同E组,同时手术当天肌注CSA 10mg/kg。B,C,D,E及F组分成2个亚组（n=6）,一个亚组观察大鼠移植后生存期,另一亚组分别于移植后7d处死大鼠,检测血清ALT,AST,TBIL水平;肝组织行HE染色,进行病理组织学检查并进行评分（根据Banff分级评分方案）;ELISA法测定E组和F组血清hIL-10的水平,TUNEL法检测肝细胞凋亡;RT-PCR检测肝组织中IL-2,IL-4,IFN-γ,hIL-10 mRNA及肝实质细胞FasL mRNA的水平;Werstern blotting测定Bcl-2及Bcl-xl蛋白的表达。结果:和E组比较:B、C及D组生存期缩短（P<0.05）,而F组明显延长（P<0.05）;移植术后7d,B、C及D组血清ALT,AST,TBIL水平升高（P<0.05）,F组降低（P<0.05）;B、C及D组排斥发应活动指数（RAI）明显升高（P<0.05）,而F组降低（P<0.05）,差异均有显著性。移植术后3d和7d,F组血清hIL-10的水平较E组升高（P<0.05）,差异均有显著性。与B、C及D组比较,移植肝IL-4mRNA及肝实质细胞FasL mRNA在E组及F组增高（P<0.05）,差异有显著性;IL-2 mRNA和IFN-γmRNA在B,C,D,E及F组比较无统计学意义,A,B,C及D移植肝不表达hIL-10 mRNA,F组hIL-10 mRNA水平较E组升高（P<0.05）。与E组及F组比较,B,C及D组Bcl-2、Bcl-xl蛋白表达弱（P<0.05）,差异均有显著性。结论:（1）Ad-hIL-10可以改善肝功能、降低移植肝RAI,延长其生存期,但并不能逆转移植肝排斥反应。CSA延长了转导基因hIL-10在移植肝的表达时间,对Ad-hIL-10抑制肝移植后急性排斥反应起协同作用。（2）Ad-hIL-10通过上调Th2细胞因子对移植肝急性排斥反应产生抑制作用。（3）Ad-hIL-10可以抑制移植肝急性排斥发应中肝细胞调亡,可能与其上调抗调亡基因Bcl-2及Bcl-xl的表达有关。（4）Ad-hIL-10对移植肝排斥反应的保护作用可能是通过FasFasL这一途径介导GICs调亡实现的。
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