论文摘要
塔斯品碱是一种阿朴啡类生物碱,是从被称为lion’s tail（或leontik）的小檗科植物Leontice ewersmannii中首次分离获得。塔斯品碱具有多种药理学活性,如抑菌作用、抗炎作用、促进伤口愈合作用、细胞毒作用、抗病毒作用等,但至今未发现塔斯品碱有抗血管生成作用的相关报道。本课题以塔斯品碱为研究对象,应用药理学、组织化学、细胞生物学以及分子生物学等方法,对其抗血管生成作用和相关作用机制进行研究。实验内容主要包括以下几个方面:1.塔斯品碱对小鼠S180肉瘤抑制作用建立小鼠S180肉瘤模型,塔斯品碱分组给药后计算抑瘤率和脾脏指数。将称重后瘤体进行4%多聚甲醛固定,进行免疫组织化学实验,考察塔斯品碱对小鼠S180肉瘤分泌的VEGF、bFGF、Bax、Bcl-2和CD34的影响,计算各组微血管密度。结果表明塔斯品碱可抑制小鼠S180肉瘤的生长,与阴性对照组比较,3个剂量组瘤重明显低于对照组,抑瘤率有显著性差异（P<0.05）。根据免疫组化实验结果,塔斯品碱组3个剂量组CD34、VEGF、bFGF、和Bcl-2表达总量显著低于模型对照组,Bax表达总量显著高于模型对照组,说明塔斯品碱能够抑制小鼠S180肿瘤分泌的VEGF、bFGF、Bcl-2的表达,上调Bax的表达,降低微血管密度。2.塔斯品碱抑制鸡胚尿囊膜血管生成作用研究建立了鸡胚尿囊膜实验模型和A549人肺腺癌移植瘤模型,考察塔斯品碱对鸡胚尿囊膜（CAM）血管生成,对A549人肺腺癌移植瘤的生长抑制作用和血管生成的影响。结果表明塔斯品碱在0.25-4.0μg /egg剂量范围内可剂量依赖性地抑制CAM血管生成,降低CAM血管数量和血管面积;在该剂量范围内,塔斯品碱能够抑制A549人肺腺癌移植瘤的生长,降低瘤体内微血管密度和VEGF表达。3.塔斯品碱对血管内皮细胞和肿瘤细胞生长抑制作用研究体外培养人脐静脉血管内皮细胞HUVEC,人肺腺癌细胞LTEP-a-2,人非小型肺腺癌细胞A549,人肺腺癌细胞SPC-A-1,人大细胞肺癌NCI-H460,人外阴上皮癌A431细胞,加入不同浓度的塔斯品碱,MTT法观察塔斯品碱对各细胞活力的影响,细胞计数法考察塔斯品碱对HUVEC和A549细胞生长曲线和倍增时间的影响,流式细胞术测定塔斯品碱对HUVEC和A549细胞周期的影响。结果表明:塔斯品碱对各细胞活力均有较好的抑制作用（A431除外）,能够抑制HUVEC和A549细胞增殖并延长其倍增时间。同时,塔斯品碱能够转化HUVEC和A549细胞周期,使细胞停滞在S期。4.塔斯品碱对HUVEC和A549细胞凋亡作用研究体外培养HUVEC和A549细胞,加入不同浓度的塔斯品碱,流式细胞术测定塔斯品碱对HUVEC和A549细胞凋亡的影响,HE染色法和透射电镜观察细胞形态、结构变化,免疫组织化学法观察塔斯品碱对HUVEC和A549细胞Bax和bcl-2蛋白表达的影响。结果表明塔斯品碱在0.06-0.66μg/mL剂量范围内能够诱导HUVEC和A549细胞凋亡,随着药物浓度和作用时间的增加,凋亡率逐渐增加,与对照组相比有显著性差异（p<0.05）。细胞经塔斯品碱作用后依次出现形状不规则,细胞收缩变圆变小,与周围细胞失去联系,胞浆浓缩,细胞核内染色质凝聚,核仁萎缩和凋亡小体等。免疫组化实验表明塔斯品碱能够降低HUVEC和A549细胞Bcl-2表达,升高Bax表达,具有较好的剂量依赖性,但是与对照组比较只有0.54μg/mL和0.66μg/mL具有显著性差异,说明塔斯品碱在低剂量时能抑制细胞增殖,在高剂量时诱导细胞凋亡。5.塔斯品碱抑制血管生成的分子机制研究建立体外细胞划伤模型,观察塔斯品碱对HUVEC和A549迁移的影响。结果表明:不同浓度（0.06-0.44μg/mL）塔斯品碱作用于HUVEC和A549细胞后,可抑制HUVEC和A549细胞的迁移,随着药物浓度的增加,迁移速度呈降低趋势,与对照组相比有显著性差异（p<0.05）。采用酶联免疫吸附实验（ELISA）法和Western blot测定塔斯品碱对HUVEC和A549细胞分泌的VEGF和bFGF的影响。结果表明:不同浓度（0.06-0.44μg/mL）塔斯品碱作用于HUVEC和A549细胞后,可抑制HUVEC和A549细胞分泌VEGF和bFGF,抑制作用具有时间和剂量依赖性。采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）考察塔斯品碱对A549细胞的VEGF mRNA表达和HUVEC细胞的VEGF、Flt-1和Flk-1/KDR mRNA表达的影响。结果表明:不同浓度（0.06-0.44μg/mL）塔斯品碱作用于HUVEC和A549细胞后,可抑制A549细胞的VEGF mRNA表达以及HUVEC的VEGF和Flk-1/KDR mRNA表达,与对照组相比有显著性差异（p<0.05）,但不能显著性地抑制Flt-1 mRNA的表达。综上所述,本课题对塔斯品碱的抗血管生成作用及其作用机制进行了研究。研究发现:（1）塔斯品碱能够抑制小鼠S180肉瘤的生长和鸡胚尿囊膜A549人肺腺癌移植瘤的生长,降低瘤体微血管密度,抑制S180肉瘤和A549移植瘤的血管生成。（2）塔斯品碱对HUVEC细胞和A549细胞增殖、迁移、倍增时间均有较好的抑制作用,能够转换HUVEC细胞和A549细胞周期,诱导HUVEC细胞和A549细胞凋亡。（3）塔斯品碱抑制血管生成作用机制是通过抑制血管内皮细胞和肿瘤细胞分泌的VEGF和bFGF的蛋白,下调A549细胞VEGF mRNA表达以及HUVEC的VEGF和Flk-1/KDR mRNA表达,从而抑制血管内皮细胞增殖、降低形成血管的能力,最终起到抗血管生成的作用。本研究为将塔斯品碱作为血管生成抑制剂的候选化合物研究开发奠定了基础。