Alu串联序列抑制GFP报告基因表达

论文摘要

目的:基因组学的研究表明,98%的基因组DNA属于非编码DNA,在非编码DNA中重复序列的含量最高,约占50%,对于这样的事实一直不能很好的解释。近年来的研究表明重复序列与多种生物学现象有关:基因转座,基因突变,肿瘤发生,自身免疫病,生物进化等。Alu元件属于重复序列中的短散布核元件（Short Interspersed Nuclear Elements）,约占人类基因组的10%,在人类基因组中约有1,000,000个拷贝。近年来越来越多的证据表明Alu序列对人类基因组的结构、功能以及进化等方面有重要的影响。虽然对重复序列的研究取得了一定的进展但是对于其功能及机理性的研究还需要进一步的探讨。本实验是在pEGFP-C1质粒的报告基因GFP的下游依次装入1, 2, 4,8,14个首尾串联的Alu序列,然后在GFP基因和Alu14（14个串联Alu）之间加入SV40早期mRNA加尾信号SV40-polyA反序（240bp）,共构建出6个重组质粒。将这些质粒转染入HeLa细胞中,观察GFP绿色荧光蛋白的表达,研究基因的下游不同长度的Alu序列对上游基因表达的影响,为短散布核元件的功能研究积累实验资料。方法:1串联表达载体构建用基因分析软件找出pEGFP-C1（pEGFP）质粒多克隆位点具有（Fig.1 Fig.2）但是待插入序列不具有的酶切位点。经分析Alu序列不含有EcoRⅠ, HindⅢ, NheⅠ, KpnⅠ和XbaⅠ酶切位点。XbaⅠ和NheⅠ两种核酸内切酶切出的粘性末端可以用T4DNA连接酶连接,但是连接以后则对XbaⅠ和NheⅠ两种核酸内切酶均不敏感。利用这种特性可以制备插有不同个数Alu串联重复序列的质粒。设计引物上游带有EcoRⅠ, XbaⅠ酶切位点,下游带有KpnⅠ,NheⅠ酶切位点,用RP11-29107克隆作为模板,扩增Alu序列。EcoRⅠ和KpnⅠ作为Alu插入的位点,制备pEGFP-Alu1（以下简称p-Alu1）。pEGFP-Alu2的制备过程为:用HindⅢ和XbaⅠ酶切构建好的pEGFP-Alu1质粒,胶回收大片段,HindⅢ和NheⅠ酶切,胶回收小片段（Fig.3）,再将大、小片断用T4DNA连接酶连接,转化DH5a感受态菌,PCR筛选含有目的序列的阳性菌,进一步用酶切和测序鉴定。反复重复上述步骤制备pEGFP-Alu4、pEGFP-Alu8。酶切和连接pEGFP-Alu4（以下简称p-Alu4）和pEGFP-Alu2（以下简称p-Alu2）质粒获得pEGFP-Alu6（以下简称p-Alu6）,再用pEGFP-Alu6和pEGFP-Alu8（以下简称p-Alu8）制备pEGFP-Alu14（以下简称p-Alu14）质粒。2 pEGFP-polyAas-Alu14（以下简称p-polyAas-Alu14）构建在p-Alu14质粒GFP基因下游插入SV40早期mRNA加尾信号SV40-polyA反序（240bp）,称为p-polyAas-Alu14。3细胞转染和荧光计数将构建好的六种质粒和pEGFP-C1以质脂体法分别转入HeLa细胞,培养24小时后在荧光显微镜下观察。在×100倍视野白光下计数细胞总数,同样视野紫兰光下计数荧光阳性细胞数并在荧光和白光下拍下细胞照片。计数细胞总数至少500个,按以下公式计算荧光细胞阳性率:荧光细胞阳性率=荧光阳性细胞数/同样视野细胞总数×100%。实验数据用均数±标准差（ x±SD）表示。结果:1构建出的p-Alu1,p-Alu2,p-Alu4,p-Alu8,p-Alu14质粒及p-polyAas-Alu14的鉴定。（1） p-Alu1,p-Alu2,p-Alu4,p-Alu8,p-Alu14质粒酶切鉴定图谱（Fig.4 Fig.5）。（2） p-polyAas-Alu14鉴定的序列和测序（Fig.6Fig.7）。2 p-Alu1、p-Alu2、p-Alu4、p-Alu8、p-Alu14、p-polyAas-Alu14和pEGFP-C1七种质粒瞬时转染HeLa细胞,24小时后荧光照片及荧光计数结果（Table 1 Fig.8 Fig.9）各质粒转染后荧光细胞阳性率均值分别为:p- Alu1 17.4±0.7%、p-Alu2 13.7±1.31%、p- Alu4 10.2±0.41%、p-Alu8 5.6±0.27%、p-Alu14 0.07±0.16%、p-polyAasAlu14 10.0±0.26%和pEGFP-C1 35.3±2.66%。结论:1成功的在pEGFP-C1质粒中插入了不同串联数目（1、2、4、8、14个）Alu序列。2在pEGFP基因的下游插入不同长度的序列可以抑制荧光报告基因的表达,并且随着长度的增加这种抑制作用增强。3上述的这种抑制作用不是由于pEGFP基因下游插入基因的增多而导致的质粒增大引起的。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 Alu 串联序列抑制GFP 报告基因的表达
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 Alu 重复序列在基因表达中的作用
• 致谢
• 个人简历