猪印记基因的分离、印记鉴定及甲基化分析

论文摘要

印记基因是指基因的表达具有亲本选择性,即只有父本或母本的等位基因表达而另一亲本的等位基因不表达或很少表达的一类基因。对哺乳动物的研究表明,印记基因在胎儿、胎盘的生长发育及胎儿出生后的表现等方面,都发挥着重要的调节作用。目前,对基因组印记的研究主要集中在人和小鼠中,在家畜特别是猪中研究比较少。因此,在猪中鉴定印记基因对于研究基因组印记在物种间的保守性和印记基因的功能都具有重要意义。本研究主要利用大梅、梅大猪及其亲本,通过RT-PCR-RFLP分析和PCR产物直接测序法检测“表达的SNP”,鉴定了猪4个候选印记基因的印记状态,以期探讨基因组印记在猪与其他物种间的保守性;在大白猪×梅山猪F2代群体中,利用PCR-RFLP技术,对2个候选印记基因进行基因型与重要经济性状的关联分析,以期探讨印记基因在育种中作为分子标记的可行性;对猪中2个候选基因中存在的CpG岛在各组织中进行甲基化分析;利用AMD方法在二月龄大白、梅山、大梅和梅大猪肌肉组织中筛选印记基因,对差异表达的EST利用“表达的SNP”进行印记验证。主要结果如下:1.根据人和小鼠印记基因的印记状况及生理功能,筛选ASCL2、NNAT、DIRAS3和DLX5基因作为猪候选印记基因。利用电子克隆和比较基因组学方法获得4个候选印记基因的cDNA序列,均包括完整的开放阅读框（Open reading frame,ORF）:（1）ASCL2,获得cDNA序列1654bp,其中为ORF 582bp,GenBank登录号为DQ666420;（2）NNAT,获得DNA序列2234bp,GenBank登录号为DQ666422,该基因包含两个转录本,两者的区别在于第二外显子的有无;（3）DIRAS3,获得cDNA序列1227bp,开放阅读框为687bp,GenBank登录号为DQ666421;（4）DLX5,获得DNA序列4108bp,开放阅读框为687bp,GenBank登录号为EU168272。猪4个候选印记基因cDNA序列与人同源序列的相似性均比与鼠同源序列的相似性高,在进化关系上,猪与人相近而与鼠则较远。2.利用大白猪×梅山猪和梅山猪×大白猪正反交模型,通过RT-PCR-RFLP分析和PCR产物直接测序法,鉴定了4个候选印记基因在二月龄猪13个组织和器官中的印记状况。（1）ASCL2基因在肌肉、脂肪、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、子宫、卵巢和垂体中均逃脱印记;（2）NNAT基因两个转录本在肌肉、脂肪、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、子宫、卵巢和垂体中均为母系印记:（3）DIRAS3基因在肌肉、脂肪、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、子宫、卵巢和垂体中母系印记:（4）DLX5基因在骨骼肌、脂肪、肺、脾、胃和小肠中表达母本来源的等位基因,即表现为父系印记;而在心、肝、肾、子宫、卵巢、睾丸和垂体中表达双亲来源的等位基因,即逃脱印记。3.利用PCR-RFLP技术,对2个候选印记基因中存在的SNP位点在不同猪群中进行基因分型,并在大白×梅山F2代群体中进行性状关联分析。结果表明:（1）ASCL2基因,C1556G位点多态性与瘦肉率、肥肉率和瘦肥比率的相关性达到极显著水平（p＜0.01）,与内脂率、股二头肌pH值和背最长肌pH值的相关性达到显著水平（p＜0.05）:（2）DLX5基因,C300T位点多态性与6-7肋间背膘厚、胸腰椎间膘厚、臀部背膘厚、平均背膘厚、肥肉率、胴体长和骨率的相关性达到极显著水平（p＜0.01）。4.DIRAS3基因第一外显子CpG岛的父本等位基因各CG位点甲基化水平整体比较低,但各组织间又有其特点:例如肌肉和肝脏中特定位点甲基化,在41个CG位点中肌肉组织偏向CG19、CG35甲基化,肝脏中偏向CG25、CG34甲基化,其他位点非甲基化;睾丸组织中41个位点中全是非甲基化;子宫组织中所有克隆子甲基化水平偏向两个极端:脾脏和肾脏中随机甲基化。而DLX5基因第一外显子CpG岛的所有CG位点都呈现非甲基化状态。5.利用24条随机引物和12条半锚定引物配对扩增,筛选到9条符合条件的EST（即在一个亲本和一个子代中表达,而在另一个亲本和另一个子代中不表达）,对符合条件的EST利用“表达的SNP”进行印记验证,结果表明ACTN3基因为非印记基因。CA3基因的表达模式分为以下四种:在卵巢中表现为印记,大梅杂合子个体表达与其母本一致的G等位基因,梅大杂合子个体表达与其母本一致的A等位基因:在肺脏和心脏中表达双亲来源的等位基因,即逃脱印记;肌肉、脂肪、子宫和睾丸中差异表达大白的等位基因,大梅杂合子个体在这些组织中表达A等位基因,即父本大白的等位基因,而梅大杂合子个体肌肉、脂肪、子宫和睾丸中也表达A等位基因,即母本大白的等位基因;肝脏和脾脏中正反交结果不一致,梅大杂合子个体在肝脏中表达A等位基因而大梅在肝脏中表达双亲等位基因,梅大杂合子个体在脾脏中表达双亲等位基因而大梅杂合子个体表达A等位基因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略表
• 第一章 前言
• 1 基因组印记的研究进展
• 1.1 基因组印记的概念及其发现
• 1.2 印记产生的几种进化理论学说
• 1.3 印记与甲基化
• 1.3.1 DNA甲基化的作用
• 1.3.2 印记去除、形成和维持过程中的甲基化变化
• 1.3.3 印记基因中的差异甲基化区（DMR）
• 1.4 基因组印记的基本特征
• 1.4.1 基因组印记的可逆性
• 1.4.2 印记中的非编码RNA
• 1.4.3 印记基因复制的不同步性
• 1.4.4 印记基因成簇存在
• 1.4.5 印记基因的保守性与特异性
• 1.5 印记异常与疾病
• 1.5.1 印记异常导致的生长发育疾病
• 1.5.2 印记异常导致的神经学疾病
• 1.5.3 印记异常导致癌症
• 1.6 印记基因的检测方法
• 2 基因组印记与动物生长发育
• 2.1 印记基因的生理功能
• 2.2 基因组印记在家畜中的研究进展
• 3 拟分离候选印记基因的研究现状
• 3.1 ASCL2基因
• 3.2 NNAT基因
• 3.3 DIRAS3基因
• 3.4 DLX5基因
• 4 研究的目的和意义
• 第二章 材料和方法
• 1 试验材料
• 1.1 DNA与RNA样品
• 1.1.1 用于基因分离及SNP检测的DNA与RNA样品
• 1.1.2 用于位点群体分型的DNA样品
• 1.1.3 性状测定及关联分析的DNA样品
• 1.1.4 用于印记及甲基化分析的DNA与RNA样品
• 1.2 主要仪器与设备
• 1.3 实验主要试剂及引物
• 1.4 常用试剂及其配制
• 1.4.1 培养基配制
• 1.4.2 其他主要化学试剂配制
• 1.5 常用的生物信息学网站和分析软件
• 2 试验方法
• 2.1 猪基因组DNA的提取
• 2.2 总RNA的提取及cDNA的制备
• 2.2.1 总RNA的提取
• 2.2.2 cDNA的制备
• 2.3 猪候选印记基因的确定
• 2.4 EST拼接和引物设计
• 2.5 PCR及PCR-RFLP分析
• 2.6 PCR产物的纯化、克隆和测序
• 2.6.1 PCR产物的纯化
• 2法）'>2.6.2 感受态细胞的制备（CaCl₂法）
• 2.6.3 纯化的PCR扩增片段的克隆
• 2.6.4 阳性克隆子的鉴定及序列测定
• 2.7 多态性分析和SNP与性状的关联分析
• 2.8 印记分析
• 2.9 亚硫酸氢盐处理DNA
• 2.10 AMD实验所需的引物、扩增及产物检测
• 2.10.1 AMD实验所需的随机引物和半锚定引物
• 2.10.2 AMD实验PCR扩增程序
• 2.10.3 聚丙烯酰胺凝胶洗胶步骤
• 2.10.4 引物配对扩增检测
• 第三章 结果与分析
• 1 总RNA的提取与cDNA的制备
• 1.1 总 RNA的提取
• 1.1.1 用于获取序列信息的总RNA提取
• 1.1.2 用于印记分析的总RNA提取
• 1.2 cDNA的制备与检测
• 2 四个候选印记基因的分离、印记鉴定和甲基化分析
• 2.1 猪ASCL2基因
• 2.1.1 猪ASCL2基因片段的克隆、测序及序列分析
• 2.1.2 猪ASCL2基因的印记分析
• 2.1.3 猪ASCL2基因C1556G位点与性状的关联分析
• 2.2 猪NNAT基因
• 2.2.1 猪NNAT基因片段的克隆、测序及序列分析
• 2.2.2 猪NNAT基因的印记分析
• 2.3 猪DIRAS3基因
• 2.3.1 猪DIRAS3基因片段的克隆、测序及序列分析
• 2.3.2 猪DIRAS3基因的印记分析
• 2.4 猪DLX5基因
• 2.4.1 猪DLX5基因片段的克隆、测序及序列分析
• 2.4.2 猪DLX5基因的印记分析
• 2.5 AMD试验筛选的候选印记EST
• 2.5.1 差异条带的筛选
• 2.5.2 差异条带的验证
• 第四章 讨论
• 1 表观遗传学研究的重要意义
• 1.1 DNA甲基化与基因表达
• 1.2 DNA甲基化与印记基因
• 1.3 DNA甲基化调控动物育种
• 2 印记基因的鉴定方法
• 2.1 基于“表达的SNP”的分析方法
• 2.2 应用正反杂交模型分析基因组印记的高效性和准确性
• 3 四个候选印记基因的印记状态
• 3.1 ASCL2基因的印记
• 3.2 NNAT基因的印记
• 3.3 DIRAS3基因的印记
• 3.4 DLX5基因的印记
• 4 印记基因作为分子标记的遗传效应
• 4.1 ASCL2基因
• 4.2 DLX5基因
• 5 候选印记基因的甲基化分析
• 6 AMD方法的可行性及局限性
• 7 印记基因在动物遗传育种中的应用
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 资源家系测定性状的英文缩写
• AMD试验中部分差异表达的EST序列