基于DNA芯片技术鼠疫耶尔森氏菌在不同条件下的转录组学研究

论文摘要

背景：鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌（以下简称鼠疫菌）引起的一种烈性传染病，其流行给人类带来了巨大的灾难。链霉素、四环素与氯霉素为治疗鼠疫的首选药物。抗生素的使用，使这种致死性疾病得到了有效控制。自然疫源地的存在、动物间鼠疫的流行、不断爆发的人间鼠疫以及多重耐药株的出现，迫使我们不得不重新面对这种古老的疾病。 鼠疫菌在体内致病的关键环节是在巨噬细胞内的生存繁殖，该菌与巨噬细胞相互作用后的转录组研究是揭示其体内生存的机制和细胞反应机制的重要依据。本研究室已经开展了鼠疫菌对温度转换、低镁离子、低铁离子、低pH、高盐、高渗、冷热休克、H2O2、抗菌肽等环境条件下的比较转录组学研究。针对鼠疫菌侵入机体后，还会遇到营养缺乏的环境因素刺激，我们对鼠疫菌进行了体外模拟不同营养条件的转录谱研究；并对鼠疫菌与小鼠腹腔巨噬细胞在体内相互作用后各自的转录谱进行了研究。通过综合分析体外模拟巨噬细胞内各种胁迫条件的转录谱与体内转录谱，为揭示鼠疫菌在胞内生存的机制奠定了基础。 方法：本研究应用鼠疫菌全基因组DNA芯片转录谱技术，研究了鼠疫菌在10×MIC链霉素、氯霉素和四环素的药物浓度作用30min下的转录谱；高营养BHI培养基与低营养TMH培养基中对数生长期与稳定期的转录谱；对数生长期与稳定期不同营养培养基中鼠疫菌的转录谱；体内鼠疫菌与小鼠腹腔巨噬细胞相互作用30min后鼠疫菌的转录谱以及小鼠腹腔巨噬细胞的转录谱。应用实时定量RT-PCR对链霉素作用转录谱的结果进行了验证，应用Cluster软件对不同条件下鼠疫菌的转录谱结果进行了聚类分析。 结果：RT—PCR验证了转录谱数据的可靠。链霉素、氯霉素以及四环素作用的差异基因345、712和177个，获得了三种抗生素作用于鼠疫菌的主要影响基因，通过聚类分析对三种不同抗生素的分子作用机理进行了认识。不同营养条件下对数生长期与稳定期的差异基因分别为246个和76个，对数生长期与稳定生长期在不同营养环境中差异基因分别为244个与251个，获得了鼠疫菌在不同生长时期与营养环境下的基因转录特点，并对产生不同转录特点的分子机理进行了分析，发现了鼠疫毒力相关基因在低营养环境中的转录特点。在体内鼠疫菌与巨噬细胞相互作用30分钟后鼠疫菌与小鼠腹腔巨噬细胞的差异基因为534个和59个。细菌体内转录谱的结果表明，在感染早期，鼠疫菌T3SS系统的转录水平显著上调，表明该系统在鼠疫菌致病过程中的重要作用。通过鼠疫菌体内转录谱与体外条件转录谱的聚类综合分析，初步获得一些与病原体在体内生长相关的基因及与致病性密切相关的毒力基因。 结论：通过研究共获得鼠疫菌在不同条件下的8个标识转录谱和一个小鼠巨噬细胞在体内与感染鼠疫菌相互作用的标识转录谱，从分子水平揭示了鼠疫菌在不同药物作用、不同生长阶段与不同营养条件以及在体内与巨噬细胞相互作用的不同转录特征。鼠疫菌与巨噬

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语
• 引言
• 1. 鼠疫的流行与危害
• 2. 鼠疫菌的病原学与致病性
• 3. 鼠疫菌的基因组学研究
• 4. 细菌基因芯片转录组学研究
• 5. 本研究的目的及意义
• 参考文献
• 第一部分 不同抗生素作用鼠疫菌的转录谱研究
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 菌株的鉴定
• 2.2.2 TMH培养基制备
• 2.2.3 鼠疫菌在 TMH培养基中的培养
• 2.2.4 链霉素氯霉素四环素最小抑菌浓度的测定
• 2.2.5 鼠疫菌全基因组 DNA芯片的制备
• 2.2.6 抗生素作用鼠疫菌转录谱
• 2.2.7 RT-PCR对链霉素作用鼠疫菌转录谱结果的验证
• 2.2.8 三种抗生素作用鼠疫菌转录谱的聚类分析
• 3. 结果与讨论
• 3.1 菌株的鉴定
• 3.2 最小抑菌浓度
• 3.3 芯片转录谱的结果
• 3.4 实时定量 RT-PCR与转录谱的相关性比较
• 3.5 抗生素作用鼠疫菌转录谱实验设计
• 3.6 链霉素作用鼠疫菌转录谱分析
• 3.7 氯霉素作用鼠疫菌转录谱分析
• 3.8 四环素作用鼠疫菌转录谱分析
• 3.9 三种抗生素作用鼠疫菌转录谱聚类分析
• 4. 小结
• 参考文献
• 第二部分 鼠疫菌不同生长阶段转录谱研究
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验菌株
• 2.2 培养基的制备
• 2.3 生长曲线的测定
• 2.4 细菌的培养
• 2.5 BHI培养基中鼠疫菌不同生长阶段 DNA芯片转录谱实验
• 2.6 TMH培养基中鼠疫菌不同生长阶段 DNA芯片转录谱实验
• 3. 结果与讨论
• 3.1 鼠疫菌的生长曲线
• 3.2 实验设计
• 3.3 BHI培养基中鼠疫菌不同生长阶段 DNA芯片转录谱分析
• 3.4 TMH培养基中鼠疫菌不同生长阶段 DNA芯片转录谱分析
• 4. 小结
• 参考文献
• 第三部分 不同营养条件鼠疫菌的转录谱研究
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验菌株
• 2.2 培养基的制备
• 2.3 生长曲线的测定
• 2.4 细菌的培养
• 2.5 对数生长期不同营养条件鼠疫菌 DNA芯片转录谱实验
• 2.6 稳定期不同营养条件鼠疫菌 DNA芯片转录谱实验
• 3. 结果与讨论
• 3.1 鼠疫菌生长曲线
• 3.2 实验设计
• 3.3 鼠疫菌在不同营养环境中的整体应答
• 4. 小结
• 参考文献
• 第四部分 鼠疫菌与小鼠腹腔巨噬细胞相互作用体内转录谱的初步研究
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 感染模型的建立
• 2.2.2 鼠疫菌 DNA芯片转录谱实验
• 2.2.3 鼠疫菌体内转录谱与体外转录谱的聚类
• 2.2.4 小鼠巨噬细胞芯片转录谱实验
• 3. 结果与讨论
• 3.1 鼠疫菌与巨噬细胞作用感染菌量与时间的选择
• 3.2 感染鼠疫菌与腹腔巨噬细胞的分离
• 3.3 鼠疫菌与腹腔巨噬细胞相互作用鼠疫菌体内转录谱分析
• 3.4 鼠疫菌体内转录谱与体外转录谱的聚类分析
• 3.5 小鼠腹腔巨噬细胞转录谱的分析
• 4. 小结
• 参考文献
• 综述
• 附表
• 发表的论文
• 致谢