固定化微环境中红豆杉细胞MAPK信号转导过程研究

论文题目: 固定化微环境中红豆杉细胞MAPK信号转导过程研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化工

作者: 程景胜

导师: 元英进

关键词: 微环境,促分裂原活化蛋白激酶,蛋白差异表达,信号转导,东北红豆杉细胞,紫杉醇,固定化培养

文献来源: 天津大学

发表年度: 2005

论文摘要: 为了更好地研究不同微环境下的植物细胞生长和生产特性,用对细胞无毒的聚氨酯泡沫作为载体构建固定化区域微环境。以东北红豆杉细胞为例,通过对细胞形态、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化、蛋白质表达等的考察,试图从细胞信号转导角度探索微环境中细胞生长和生产基本规律。在细胞固定化培养之前,将圆柱形泡沫(半径:7.5mm,高:15mm)从边缘到中心分成0~3mm和3~7.5mm两个区域。通过考察生长在泡沫表面、泡沫中0~3mm和3~7.5mm三个区域(外、中、内层)红豆杉细胞活力、有丝分裂指数(MI)、细胞分化、紫杉醇含量的变化,以展示固定化不同区域细胞所处的理化微环境差异。20天后固定化不同区域细胞的MI表现为:外层>中层>内层;细胞分化程度和紫杉醇含量表现为:外层<中层<内层。运用免疫荧光技术和Western blot方法考察固定化对细胞壁中信号分子(阿拉伯半乳糖蛋白,AGPs)表达的影响。发现与普通悬浮培养相比,固定化培养提高了AGPs的表达水平。20天后内层、中层细胞中AGPs表达比外层和悬浮培养细胞中的AGPs表达高。AGPs表达上升时,细胞分化程度和紫杉醇产量得到提高。运用Western blot方法考察了固定化细胞中胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun N-terminal kinases (JNK)和p38-like MAPK的磷酸化水平,从信号转导角度揭示固定化微环境对红豆杉细胞生长和生产的影响机制。发现20天后固定化细胞中ERK-like MAPK活性表现为:外层>中层>内层,这些变化与不同区域中营养物浓度梯度相关。固定化细胞中ERK活性与细胞MI呈正相关,与细胞分化程度、紫杉醇生产和AGPs表达呈负相关。同时发现固定化培养提高了细胞中52-kDa JNK-like MAPK磷酸化水平,降低了45-kDa JNK-like和41-kDa p38-like MAPK磷酸化水平。主要是47-kDa和45-kDa JNK的磷酸化参与固定化对细胞的水剪切力保护,而不是52-kDa JNK或p38 MAPK的磷酸化。运用二维凝胶电泳和质谱技术,从蛋白质表达水平揭示固定化微环境中红豆杉细胞生长生产特性。经质谱鉴定后发现部分差异表达蛋白参与调节细胞中氮、硫和糖类的代谢。固定化培养增强了细胞中UDPG pyrophosphorylase的表达,该酶直接或间接参与细胞壁多糖的合成。腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)表达增强时,MI增加;SAMS表达降低时,MI下降。

论文目录:

中文摘要

ABSTRACT

前言

第一章 文献综述

1.1 引言

1.2 植物细胞培养与微环境

1.2.1 微环境概述

1.2.2 植物细胞培养方式与微环境形成

1.2.2.1 微环境与两阶段培养

1.2.2.2 微环境与两相培养

1.2.2.3 微环境与固定化培养

1.2.2.3.1 固定化微环境的形成机制

1.2.2.3.2 植物细胞在固定化培养微环境中的生物学效应

1.3 环境胁迫与植物细胞信号转导途径

1.3.1 植物细胞壁中信号分子阿拉伯半乳糖蛋白(Arabinogalactan-proteins, AGPs)与细胞信号转导

1.3.1.1 AGPs 的特性及分布

1.3.1.2 AGPs 在植物细胞信号转导中的作用

1.3.1.3 AGPs 与植物细胞分化

1.3.2 植物细胞MAPKs 信号转导途径与植物细胞防御反应

1.3.2.1 植物细胞中的MAPKs 信号转导途径

1.3.2.2 植物细胞中MAPKs 信号转导与环境胁迫

1.3.2.3 植物细胞中MAPKs 信号转导途径与细胞分裂

1.3.2.4 植物细胞中MAPKs 信号转导途径与细胞分化

1.3.2.5 红豆杉细胞中信号转导与环境胁迫

1.4 植物细胞蛋白质差异表达与环境适应

1.4.1 植物细胞蛋白质差异表达与细胞生长发育

1.4.2 植物细胞蛋白质组差异表达与环境应答

1.5 本文研究意义及主要研究内容

第二章 细胞固定化培养区域微环境的建立

2.1 引言

2.2 研究材料与方法

2.2.1 主要仪器设备

2.2.2 主要试剂及药品配制

2.2.3 细胞株系及其培养

2.2.4 细胞活性测定

2.2.5 TBO 染色

2.2.6 细胞有丝分裂检测

2.2.7 紫杉醇的提取与测定

2.2.7.1 胞内紫杉醇的提取

2.2.7.2 胞外紫杉醇的提取

2.2.7.3 紫杉醇含量的测定

2.2.8 实验设计与数据处理

2.3 结果与讨论

2.3.1 细胞固定化培养区域微环境的建立

2.3.2 固定化培养对东北红豆杉细胞活力的影响

2.3.3 固定化培养对东北红豆杉细胞有丝分裂活动的影响

2.3.4 固定化培养对东北红豆杉细胞紫杉醇生产的影响

2.3.5 固定化培养载体中不同区域细胞的分裂指数、分化和紫杉醇含量的变化

2.4 小结

第三章 固定化微环境对红豆杉细胞壁中信号分子阿拉伯半乳糖蛋白表达的影响

3.1 引言

3.2 研究材料与方法

3.2.1 主要仪器设备

3.2.2 主要试剂及药品配制

3.2.3 细胞株系及其培养

3.2.3.1 固定化细胞的继代培养

3.2.4 蛋白质标准曲线的绘制及浓度的测定

3.2.5 AGPs 检测

3.2.5.1 可溶性 AGPs 提取

3.2.5.2 免疫荧光法检测红豆杉细胞中 AGPs 的表达

3.2.5.3 免疫印迹法(Western Blotting)测定可溶性 AGPs 的表达

3.2.6 紫杉醇的提取与测定

3.2.7 实验设计与数据处理

3.3 结果与讨论

3.3.1 固定化培养对红豆杉细胞中AGPs 表达的影响

3.3.1.1 细胞中与抗体(JIM 13)发生免疫反应的 AGPs 的荧光免疫检测

3.3.1.2 细胞中与抗体(JIM 13)发生免疫反应的 AGPs 表达的 Western blot 分析

3.3.2 继代培养对固定化红豆杉细胞中 AGPs 表达的影响

3.3.3 MJ 对红豆杉细胞中 AGPs 表达的影响

3.4 小结

第四章 固定化微环境对东北红豆杉细胞中ERK-like MAPK 活性的影响

4.1 引言

4.2 研究材料与方法

4.2.1 主要仪器设备

4.2.2 主要试剂及药品配制

4.2.3 细胞株系及其培养

4.2.4 蛋白质标准曲线的绘制及浓度的测定

4.2.5 TBO 染色

4.2.6 胶内phosphro-ERK-like MAPK 活性测定

4.2.7 免疫印迹法(Western Blotting)检测 ERK-like MAPK 活性

4.2.8 实验设计与数据处理

4.3 结果与讨论

4.3.1 固定化培养对红豆杉细胞中ERK-like MAPK 活性的影响

4.3.2 固定化培养载体中不同区域细胞ERK-like MAPK 活性的变化

4.3.3 B5 培养基浓度对红豆杉细胞中ERK-like MAPK 活性的影响

4.3.4 红豆杉细胞中 ERK-like MAPK 活性与 AGP 表达水平间的关系

4.3.5 特异性抑制剂 PD98059 对东北红豆杉细胞生长和生产的影响

4.4 小结

第五章 固定化微环境对东北红豆杉细胞中JNK-like和p38-like MAPK 磷酸化水平的影响

5.1 引言

5.2 研究材料与方法

5.2.1 主要试剂及药品配制

5.2.2 细胞株系及其培养

5.2.3 蛋白质标准曲线的绘制及浓度的测定

5.2.4 细胞活性测定

5.2.5 免疫印迹法(Western Blotting)测定蛋白质的表达

5.2.6 实验设计与数据处理

5.3 结果与讨论

5.3.1 固定化培养对红豆杉细胞中JNK-like MAPK 磷酸化水平的影响

5.3.2 固定化培养对红豆杉细胞中p38-like MAPK 磷酸化水平的影响

5.3.3 摇床速度对红豆杉细胞中JNK-like 和p38-like MAPK 磷酸化水平的影响

5.3.4 短期层流场剪切力胁迫对红豆杉细胞中JNK-like 和p38-like MAPK 磷酸化水平的影响

5.3.5 JNK 或 p38 MAPK 的特异性抑制剂对红豆杉细胞 JNK-like 和 p38-like MAPK 磷酸化水平的影响

5.4 小结

第六章 固定化微环境中东北红豆杉细胞蛋白质差异表达的研究

6.1 引言

6.2 研究材料与方法

6.2.1 主要仪器设备

6.2.2 主要试剂及药品配制

6.2.3 细胞株系及其培养

6.2.4 蛋白质二维凝胶电泳及差异表达蛋白的质谱鉴定

6.2.5 实验设计与数据处理

6.3 结果与讨论

6.3.1 固定化不同区域微环境中东北红豆杉细胞蛋白质的表达

6.3.2 固定化培养不同时期东北红豆杉细胞蛋白质的表达

6.3.3 差异表达蛋白的质谱鉴定

6.4 小结

第七章 结论与展望

7.1 结论

7.2 展望

参考文献

发表论文及参加科研情况

附录

致谢

发布时间: 2007-07-10

参考文献

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• [3].剪切力作用下红豆杉细胞一氧化氮和MAPK调控模型的动态特征[D]. 龚彦文.天津大学2006
• [4].红豆杉细胞培养过程中褐化机理及其控制[D]. 董艳山.华中科技大学2015
• [5].南方红豆杉细胞中紫杉烷生物合成途径及其诱导调控研究[D]. 王艳东.天津大学2003
• [6].铈诱导子强化红豆杉细胞次生代谢产物生产的信号机制研究[D]. 杨松.天津大学2007
• [7].紫杉醇高产菌株和细胞系的选育[D]. 张鹏.华中科技大学2008

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