论文题目: 昆虫病原真菌金龟子绿僵菌中性海藻糖酶在孢子储藏稳定性中的作用
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物医学工程
作者: 胡宗利
导师: 蔡绍晳,夏玉先
关键词: 金龟子绿僵菌,中性海藻糖酶,储藏稳定性,真菌转化,干扰
文献来源: 重庆大学
发表年度: 2005
论文摘要: 蝗虫是世界性的害虫,给农业生产带来了严重的经济损失。金龟子绿僵菌是一种蝗虫病原真菌,在蝗虫生物防治中起着重要作用。目前,世界上已经有十多个金龟子绿僵菌菌株登记注册,并实现了商品化,但这些产品常常不稳定。阻碍绿僵菌杀虫剂大规模应用的主要原因之一是孢子的储藏和环境稳定性问题。本实验室从我国蝗虫病原菌中分离、选育出一株高毒力、高产孢、强专化性的杀蝗新菌株金龟子绿僵菌CQMa102,用该绿僵菌生产的孢子粉及其油悬浮剂已在国内登记注册,正逐步实现商品化,却也同样存在进一步延长储藏期,增强环境稳定性的问题。大量研究报道,海藻糖是广泛存在于各种生物体内的抗逆境剂,具有增强生物体对高温、脱水、干旱、冷冻、高渗透性、重金属及有毒试剂等逆境的抵抗能力。胞内海藻糖积累与丝状真菌孢子的储藏期延长密切相关。将酿酒酵母细胞内中性海藻糖酶基因敲除后,中性海藻糖酶活性丧失,海藻糖含量提高3 倍。由此我们可以推测,通过基因工程技术改变绿僵菌体内海藻糖代谢途径,可以提高孢子内海藻糖含量,延长绿僵菌孢子的储藏期,增强其环境稳定性,促进其商品化生产和应用。要通过改变海藻糖代谢途径来改良绿僵菌菌种,就必须了解绿僵菌体内海藻糖的代谢和调控,但是人们对绿僵菌体内海藻糖的代谢研究得较少,夏玉先等首先克隆了金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因,但其生物学功能还未见报道。本研究拟通过增加金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因的拷贝数以减少孢子形成过程中海藻糖的合成,采用基因破坏技术去除或降低金龟子绿僵菌中性海藻糖酶活性以增加孢子中海藻糖含量,并进一步分析孢子中海藻糖的含量及其与孢子抗逆能力和耐储藏能力的关系,从而阐明中性海藻糖酶在孢子耐热力和储藏稳定性中的作用。本研究利用PCR、RT-PCR、RACE、panhandle PCR 等方法成功地克隆了金龟子绿僵菌CQMa102 中性海藻糖酶基因,并登录NCBI 的GenBank, 登录号为:AY557613（基因组序列）, AY557612（cDNA 序列）。根据该基因序列构建了金龟子绿僵菌中性海藻糖酶超表达载体、同源置换载体和RNA 干扰载体,分别利用PEG-CaCl2 介导法、电转化法和基因枪法,转化金龟子绿僵菌CQMa102,经过PCR 筛选和Southern blot 验证,获得3 个中性海藻糖酶超表达转化菌和3 个RNAi 转化菌。利用Northern blot 分析这几个突变菌株中性海藻糖酶基因mRNA 的含量,选择中性海藻糖酶基因超表达2 倍和中性海藻糖酶基因被抑制到42%的两个转化菌:Ma113 和Ma688,将其与出发菌株进行分生孢子内海藻糖含量的测定,孢子储藏
论文目录:
中文摘要
英文摘要
1 绪论
1.1 研究背景
1.1.1 蝗灾严重威胁着全世界农作物的生产
1.1.2 国内外蝗虫生物防治研究进展
1.1.3 绿僵菌杀蝗剂的优点及在研发和应用中存在的问题
1.1.4 海藻糖是生物体内的抗逆境剂
1.1.5 真菌海藻糖酶研究进展
1.2 研究目的和意义
1.3 研究目标和整体设计
1.3.1 研究目标
1.3.2 研究思路构架
1.4 研究内容和技术路线
1.4.1 金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因的克隆及表达特性分析
1.4.2 金龟子绿僵菌NTL 超表达载体的构建
1.4.3 金龟子绿僵菌NTL 同源置换载体的构建
1.4.4 金龟子绿僵菌NTL RNA 干扰载体的构建
1.4.5 NTL 超表达、同源置换和RNA 干扰载体转化金龟子绿僵菌原生质体
1.4.6 NTL 超表达、同源置换和RNA 干扰载体转化金龟子绿僵菌分生孢子
1.4.7 转化子和出发菌株在分子生物学及生理生化特性上的比较分析
1.5 本研究的创新性
2 材料和方法
2.1 金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因的克隆及表达特性分析
2.1.1 试验菌株与质粒
2.1.2 主要仪器设备
2.1.3 主要试剂
2.1.4 金龟子绿僵菌CQMa102 总DNA 的提取
2.1.5 CQMa102 NTL 同源片段的PCR 扩增、克隆及序列测定
2.1.6 利用5’RACE 和3’RACE 克隆NTL 基因5’端和3’端cDNA 序列
2.1.7 金龟子绿僵菌CQMa102 NTL 基因组全长的PCR 扩增和克隆
2.1.8 NTL 基因上游序列的panhandle PCR 扩增、克隆、测序及验证
2.1.9 金龟子绿僵菌中性海藻糖酶基因表达特性分析
2.2 NTL 基因超表达载体、同源置换载体、RNA 干扰载体的构建
2.2.1 试验菌株与质粒
2.2.2 主要仪器设备
2.2.3 主要试剂
2.2.4 金龟子绿僵菌NTL 超表达载体的构建
2.2.5 金龟子绿僵菌NTL 同源置换载体的构建
2.2.6 金龟子绿僵菌RNA 干扰载体的构建
2.3 NTL 超表达、同源置换和RNA 干扰载体转化金龟子绿僵菌原生质体
2.3.1 试验菌株和质粒
2.3.2 主要仪器设备
2.3.3 主要试剂
2.3.4 金龟子绿僵菌原生质体的制备
2.3.5 NTL 超表达、同源置换和RNA 干扰载体的酶切
2.3.6 CaCl_2/PEG 介导法转化金龟子绿僵菌原生质体
2.3.7 电激法转化金龟子绿僵菌原生质体
2.3.8 稳定转化子的筛选
2.3.9 金龟子绿僵菌原生质体对潮霉素B(hygromycin B)的抗性实验
2.3.10 金龟子绿僵菌原生质体对苯莱特(benomyl)的抗性实验
2.3.11 短片段同源置换载体转化子的抗性和PCR 筛选
2.3.12 长片段同源置换、超表达和RNA 干扰载体转化子的抗性和PCR 筛选
2.4 NTL 超表达、长片段同源置换和RNA 干扰载体转化金龟子绿僵菌分生孢子
2.4.1 试验菌株和质粒
2.4.2 主要仪器设备
2.4.3 主要试剂
2.4.4 金龟子绿僵菌分生孢子的培养、收集和预处理
2.4.5 外源质粒DNA 包被于金粉内
2.4.6 基因枪法转化金龟子绿僵菌分生孢子
2.4.7 稳定转化子的筛选
2.4.8 金龟子绿僵菌CQMa102 分生孢子对苯莱特的抗性实验
2.4.9 超表达、长片段同源置换和RNA 干扰载体转化子的抗性和PCR 筛选
2.4.10 超表达和RNA 干扰载体转化子的Southern 杂交验证
2.5 转化子与出发菌株在分子生物学和生理生化特性上的比较分析
2.5.1 试验菌株
2.5.2 主要仪器设备
2.5.3 主要试剂
2.5.4 对数生长期NTL mRNA 表达量比较分析
2.5.5 转化菌株和出发菌株孢子内海藻糖含量的测定
2.5.6 转化菌株和出发菌株孢子耐贮性的比较分析
2.5.7 转化菌株和出发菌株孢子耐热性的比较分析
2.5.8 转化菌株和出发菌株生长特性的比较
3 结果与分析
3.1 金龟子绿僵菌CQMa102 NTL 基因同源片段的克隆和分析
3.1.1 NTL 基因同源片段的扩增结果
3.1.2 NTL 基因同源片段的测序结果
3.1.3 NTL 基因同源片段A 的序列分析
3.2 5’RACE 和3’RACE 克隆NTL 基因5’端和3’端cDNA 序列
3.3 金龟子绿僵菌CQMa102 NTL 基因的克隆和分析
3.4 金龟子绿僵菌CQMa102 NTL 基因上游调控序列的克隆和分析
3.5 金龟子绿僵菌CQMa102 NTL 基因的Southern 杂交分析
3.6 金龟子绿僵菌CQMa102 NTL 基因的表达特性分析
3.7 金龟子绿僵菌CQMa102 NTL 超表达载体的构建、超表达转化子的筛选和鉴定
3.7.1 NTL 超表达载体的构建和鉴定
3.7.2 金龟子绿僵菌CQMa102 原生质体的制备
3.7.3 金龟子绿僵菌CQMa102 原生质体对苯莱特的抗性实验
3.7.4 金龟子绿僵菌CQMa102 分生孢子对苯莱特的抗性实验
3.7.5 NTL 超表达转化子的筛选
3.7.6 NTL 超表达转化子的Southern blot 鉴定
3.8 金龟子绿僵菌CQMa102 NTL 短片段同源置换载体的构建、同源置换转化子的筛选
3.8.1 NTL 短片段同源置换载体的构建和鉴定
3.8.2 金龟子绿僵菌CQMa102 原生质体对潮霉素B 的抗性实验
3.8.3 NTL 短片段同源置换转化子的筛选
3.9 金龟子绿僵菌CQMa102 NTL 长片段同源置换载体的构建、同源置换转化子的筛选
3.9.1 NTL 长片段同源置换载体的构建和鉴定
3.9.2 NTL 长片段同源置换转化子的筛选
3.10 金龟子绿僵菌CQMa102 NTL RNA 干扰载体的构建、干扰载体转化子的筛选和鉴定
3.10.1 RNA 干扰载体的构建和鉴定
3.10.2 RNA 干扰载体转化子的筛选
3.10.3 RNA 干扰转化子的Southern blot 鉴定
3.11 转化菌株和出发菌株在对数生长期的NTL mRNA 表达量比较分析
3.12 转化菌株Ma688、 Ma113 和出发菌株孢子内海藻糖含量的测定
3.13 转化菌株Ma688、Ma113 和出发菌株孢子耐贮性的比较分析
3.14 转化菌株Ma688、 Ma113 和出发菌株孢子耐热性的比较分析
3.15 转化菌株和出发菌株生长特性的比较
3.15.1 在1/4SDA 平板上的生长情况
3.15.2 在固体培养基上的产孢率比较分析
4 讨论
4.1 真菌的遗传转化方法及其评价
4.1.1 以PEG 等化学物质介导的遗传转化
4.1.2 以限制酶介导的遗传转化
4.1.3 以根癌农杆菌介导的遗传转化
4.1.4 电激法
4.1.5 基因枪法
4.1.6 显微注射法
4.1.7 激光微束穿孔法
4.2 基因打靶的策略及其评价
4.3 RNA 干扰技术使基因敲低或基因沉默
4.3.1 RNA 干扰的发现和发展
4.3.2 RNA 干扰可能的作用机制
4.3.3 RNA 干扰技术在功能基因组研究中的应用
4.3.4 RNA 干扰技术的缺陷
4.4 金龟子绿僵菌孢子内海藻糖含量与孢子耐贮性的关系
4.5 中性海藻糖酶与孢子耐贮性、耐热性的关系
5 结论
致谢
参考文献
附录1 作者在攻读博士学位期间发表的论文目录
附录2 测序结果
独创性声明
学位论文版权使用授权书
发布时间: 2005-11-07
参考文献
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