乙型肝炎病毒拉米夫定耐药株变异率快速检测方法的建立及应用研究

论文摘要

全世界有3.5亿乙肝病毒感染者。乙肝病毒(HBV)是导致肝硬化和肝癌的重要因素,60%～80%的肝癌患者是乙肝病人。随着对乙肝病毒治疗的深入研究,各种抗病毒药物应运而生。拉米夫定是有效抑制乙肝病毒复制的核苷类似物之一。但是,长时间用药会导致乙肝病毒出现YMDD区段发生变异,即HBV逆转录酶的保守序列YMDD中M(蛋氨酸)被V(缬氨酸)或I(异亮氨酸)所取代,变异后成为YVDD(rtM204V)或YIDD(rtM204I),导致HBV对拉米夫定产生耐药,使患者体内病毒复制反弹。本研究通过设计变异位点的选择性引物及共用探针,利用荧光定量PCR技术,建立了一种快速、有效的乙肝病毒YMDD变异率的检测方法。突变毒株在病毒群体中的百分比可以根据突变株和对照的Ct值差异进行计算。包含耐药突变的质粒经过系列稀释、混合后进行检测,以及对未经拉米夫定治疗的98例慢性乙肝患者和145例拉米夫定治疗的慢性乙肝患者进行耐药突变检测,与测序方法进行对照,对结果不符的标本再进行亚克隆测序验证。并用该方法对268例经拉米夫定治疗的不同时间患者进行病毒变异率检测。对98例经拉米夫定治疗和64例经拉米夫定与干扰素a序贯治疗的e抗原阴性患者进行病毒变异率检测,验证序贯治疗的效果及其对拉米夫定变异的抑制作用。同时,对患者体内的T淋巴细胞活性及T淋巴细胞亚群情况、肝组织治疗前后病理学变化等进行了进一步分析。该方法可以在10~6～10~9拷贝/毫升HBV的血清标本中检测到0.1%的突变毒株。145例拉米夫定治疗的慢性乙肝患者中,检测到42例耐药突变株,突变比例为5～100%。6例与测序结果不符的标本突变比例为5～20%,低于测序方法的检测下限,与亚克隆测序的结果相符。98例未经拉米夫定治疗的慢性乙肝患者中有5例检测到耐药突变,变异比例为10～20%。拉米夫定治疗组的拉米夫定耐药株变异率(22.45%)显著高于序贯治疗组。实验结果表明,本研究所建立的拉米夫定耐药株变异检测方法快速灵敏,可以用于临床治疗中拉米夫定耐药变异的监测,为临床治疗方案的选择提供可靠依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 引言
• 1 乙肝病毒YMDD变异检测及治疗进展
• 1.1 病毒基因组
• 1.1.1 双链
• 1.1.2 粘性末端
• 1.2 基因组成
• 1.2.1 S-ORF
• 1.2.2 C-ORF
• 1.2.3 X-ORF
• 1.2.4 P-ORF
• 1.2.5 结构特点
• 1.3 HBV致病机理
• 1.3.1 HBV感染早期的病毒复制与固有免疫
• 1.3.2 HBV感染早期的病毒复制与适应性免疫
• 1.3.3 慢性HBV感染的病毒动力学
• 1.3.4 慢性HBV感染的免疫动力学——适应性免疫的削弱
• 1.4 临床诊断
• 1.4.1 慢性乙型肝炎
• 1.4.2 乙型肝炎肝硬化
• 1.4.3 携带者
• 1.4.4 隐匿性慢性乙型肝炎
• 1.5 乙型肝炎的治疗进展
• 1.5.1 免疫增强剂
• 1.5.2 核苷（酸）类似物治疗
• 1.5.3 免疫调节治疗
• 1.5.4 治疗性疫苗
• 1.5.5 基因疗法
• 1.5.6 抗体性药物
• 1.5.7 其他抗病毒药物及中药治疗
• 1.6 抗病毒治疗的推荐意见
• 1.6.1 慢性HBV携带者和非活动性HBsAg携带者
• 1.6.2 HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者
• 1.6.3 代偿期乙型肝炎肝硬化患者
• 1.6.4 失代偿期乙型肝炎肝硬化患者
• 1.6.5 应用化疗和免疫抑制剂治疗的患者
• 1.6.6 肝移植患者
• 1.6.7 HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者治疗推荐意见
• 1.7 治疗的总体目标
• 1.7.1 抗病毒治疗的一般适应症
• 1.7.2 抗病毒治疗的应答
• 1.8 拉米夫定耐药株（YMDD）变异检测方法进展及与病毒基因型的关系
• 1.8.1 乙肝病毒YMDD变异
• 1.8.2 变异检测方法
• 1.8.3 YMDD变异与病毒基因分型
• 1.9 本研究的设计思路、工作内容及安排
• 1.9.1 方法学建立
• 1.9.2 应用所建立的方法监测拉米夫定治疗过程中的耐药突变
• 1.9.3 将所建立的方法应用于序贯治疗研究
• 1.10 参考文献
• 2 乙型肝炎病毒拉米夫定耐药株变异率快速检测方法建立
• 2.1 材料和试剂
• 2.1.1 标本来源
• 2.1.2 试剂与仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 血清HBV DNA的提取
• 2.2.2 质粒控制
• 2.2.3 引物及探针设计
• 2.2.4 病毒变异率计算
• 2.2.5 DNA序列测定
• 2.2.6 HBV亚克隆
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 引物与探针的特异性
• 2.3.2 检测的敏感度与检测限
• 2.3.3 错配实验
• 2.3.4 实时荧光PCR结果与测序对比
• 2.3.5 YMDD部分测序结果
• 2.3.6 检测时间
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 2.6 参考文献
• 3 拉米夫定耐药株变异率的快速检测之应用一:慢性乙肝患者拉米夫定耐药突变的临床诊断
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 标本来源
• 3.1.2 试剂与仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 血清HBV DNA提取
• 3.2.2 血清HBV DNA定量测定
• 3.2.3 拉米夫定耐药株的检测
• 3.2.4 统计学处理
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 不同治疗时间血清HBV DNA阳性率变化
• 3.3.2 拉米夫定治疗过程中的YMDD变异分析
• 3.3.3 YMDD突变病毒株占病毒群体的比例
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 3.6 参考文献
• 4 拉米夫定耐药株变异率的快速检测之应用二:拉米夫定与干扰素a序贯治疗e抗原阴性中国患者变异率
• 4.1 材料和试剂
• 4.1.1 标本来源
• 4.1.2 试剂与仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 患者分组
• 4.2.2 YMDD变异检测
• 4.2.3 HBV DNA检测及ALT水平检测
• 4.2.4 乙肝表面标志物检测
• 4.2.5 病毒基因分型
• 4.2.6 肝组织病理学检测
• 4.2.7 外周血T淋巴细胞AgNORs（嗜银蛋白含量）检测
• 4.2.8 外周血T淋巴细胞亚群绝对值检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 患者基本状况
• 4.3.2 拉米夫定耐药株检测结果
• 4.3.3 生物化学应答
• 4.3.4 病毒学应答
• 4.3.5 肝组织变化
• 4.3.6 拉米夫定组与序贯治疗组嗜银蛋白（AgNORs I.S%）含量变化
• 4.3.7 拉米夫定组与序贯治疗组治疗前后外周血T淋巴细胞亚群绝对值变化
• 4.3.8 病毒基因分型与YMDD变异关系研究
• 4.3.9 不良反应
• 4.4 讨论
• 4.5 结论
• 4.6 参考文献
• 5 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 展望
• 论文创新点
• 攻读博士学位期间发表学术论文情况
• 致谢