雪里蕻滞绿基因SGR的克隆及转化研究

论文摘要

绿色植物的叶片由于含有丰富的叶绿素而呈现绿色,植物物种间或者同一物种的不同时期可以呈现出不同的颜色也是由于不同的色素所造成的。其色素组成受遗传和环境刺激的影响,是其合成与降解之间相互平衡的结果。近年来,叶绿素的合成途径已经研究的比较清楚,而对于其降解途径,随着水稻中sgr（t）滞绿突变体的发现及SGR基因的识别,研究者对于叶绿素降解的起始阶段又有了新的认识。目前,SGR基因已经在很多物种中被发现,它的功能缺失可以导致绿色植物出现滞绿突变,但是其机制目前还不清楚。通过对更多的SGR基因及其滞绿突变体进行研究,对于探明SGR基因的作用机制及叶绿素降解途径将有所帮助。本课题中,我们分析了已报道的各物种SGR滞绿基因的同源性,并设计特异引物,分别克隆了雪里蕻和白菜的SGR基因的编码区。对获得的基因序列进行了生物信息学分析,并对雪里蕻SGR基因的表达模式进行了分析。为了进一步研究雪里蕻和白菜SGR基因的功能,本研究构建了雪里蕻和白菜SGR基因的RNAi沉默载体,并采用了农杆菌介导的花序浸染法和组织培养转化法,进行了雪里蕻的遗传转化。本研究的主要结果如下:①成功的克隆了雪里蕻和白菜的SGR基因的编码区,测序结果表明,雪里蕻和白菜的SGR基因序列都是807bp,它们几乎完全相同,只有三个碱基的差别。雪里蕻SGR基因与拟南芥NYE1的同源性为85%、乌塌菜91%、烟草77%、番茄76%等。②通过生物信息学分析表明,雪里蕻和白菜的SGR基因都编码了268个氨基酸残基,并且序列完全相同,分子量为30.3kD,等电点为8.56。同时雪里蕻SGR基因编码的蛋白是一个具有N末端叶绿体转运肽与信号肽的非分泌蛋白。在细胞亚结构中可能定位于叶绿体中,分布于叶绿体基质、淀粉体。由于其不具跨膜结构,而又具有多个磷酸化位点,因此可能是在细胞中直接参与信号的传导或者反应。其编码的氨基酸序列和其它SGR蛋白有很高的同源性,并且和其它SGR蛋白一样都含有一个高度保守的C末端基序（C-X3-C-X-C2-F-P-X5-P）,与拟南芥NYE1蛋白的同源性为87%、水稻61%。和芸薹属中乌塌菜的SGR蛋白的同源性为92%,除了中间插入的21个氨基酸外,只有一个氨基酸的差别。通过和其它物种的氨基酸序列对比发现,对于乌塌菜多出的21个氨基酸序列,除了结缕草的整个氨基酸序列较短外,其它物种中都不具有这个序列。这进一步说明这个序列很可能是后期插入的,而乌塌菜的SGR基因也可能因此造成功能缺失。③雪里蕻SGR基因（Brassica juncea var. crispifolia ,BjSGR）表达模式分析表明,BjSGR基因受衰老诱导而特异地表达。在幼嫩叶中表达量很低,而在绿色稍微褪去的衰老叶片中其表达量迅速增加。④通过对拟南芥花序浸染法的探索和改进,采取用移液枪点滴重悬液的方式转化雪里蕻（雪里蕻,Brassica juncea var.crispifolia）花蕾,最终获得了转基因雪里蕻。同时通过对影响转化效率的蔗糖浓度、表面活性剂浓度、菌液OD600值等进行研究,发现用5%的蔗糖（w/v）+0.03%的Silwet-77（v/v）重悬农杆菌,使重悬液的菌液浓度OD600为0.8时,可以获得较高的转化效率,转化率为2.3%。该方法避免了真空操作及浸染时间的影响,使得操作更加简便,且转化周期更短,为雪里蕻的遗传转化提供了一种更为简便的转化方法。⑤在组织培养转化法中,通过对外植体的选择以及激素配比研究发现,2 mg/ L 6-BA + 0. 2 mg/ L NAA组的子叶的芽再生率较高,并且获得了抗性苗,目前处于诱导生根阶段。这为以后研究雪里蕻和白菜SGR基因的功能打下了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 1 文献综述
• 1.1 叶绿素降解的研究背景
• 1.1.1 叶绿素降解的研究历史
• 1.1.2 叶绿素降解的代谢途径
• 1.1.3 叶绿素降解的意义
• 1.2 滞绿突变及突变体
• 1.2.1 滞绿突变
• 1.2.2 滞绿突变体
• 1.2.3 形成滞绿突变体的原因
• 1.2.4 滞绿突变的意义
• 1.3 植物转基因技术
• 1.3.1 植物转基因技术研究进展
• 1.3.2 几种常用的植物转基因技术
• 1.3.3 植物转基因技术的应用
• 1.4 课题意义和目标
• 1.4.1 课题意义
• 1.4.2 研究内容和目标
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 试剂与主要仪器
• 2.3 常用实验方法
• 2.3.1 碱裂解法提取质粒
• 2 法'>2.3.2 大肠杆菌JM109/DH5α感受态细胞的制备——CaCl₂法
• 2.3.3 重组质粒DNA 的转化
• 2.4 白菜和雪里蕻滞绿基因SGR 的克隆及分析
• 2.4.1 引物设计
• 2.4.2 总RNA 提取
• 2.4.3 反转录（RT）与PCR 扩增
• 2.4.4 PCR 产物的纯化、连接及转化
• 2.4.5 阳性转化子的鉴定
• 2.4.6 测序及雪里蕻SGR 基因序列的分析
• 2.5 白菜和雪里蕻滞绿基因SGR 的功能研究及分析
• 2.5.1 雪里蕻BjSGR 的表达模式研究
• 2.5.2 滞绿基因SGR 的生物信息学分析
• 2.5.3 RNAi 沉默载体的构建
• 2.5.4 雪里蕻的遗传转化
• 2.5.5 黑暗处理实验
• 2.6 雪里蕻转基因方法研究
• 2.6.1 花序浸染转化法研究
• 2.6.2 组织培养转化法研究
• 3 结果与讨论
• 3.1 白菜和雪里蕻滞绿基因SGR 的克隆
• 3.2 白菜和雪里蕻滞绿基因SGR 生物信息分析
• 3.3 雪里蕻滞绿基因SGR 表达特异性及功能分析
• 3.4 载体的构建
• 3.5 雪里蕻的遗传转化
• 3.5.1 改进的花序浸染法
• 3.5.2 组织培养转化法
• 3.6 转基因雪里蕻的表型分析
• 4 结论与展望
• 4.1 主要结论
• 4.2 后续研究工作展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• A. 作者在攻读硕士学位期间发表的论文
• B. 作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目