ISG15的原核表达和多克隆抗体的制备及其与猪瘟病毒相互作用的初步研究

论文摘要

猪瘟病毒是猪烈性传染病猪瘟的病原,属于黄病毒科瘟病毒属,是一种单股正链的RNA病毒,能够在感染的猪体内引起持续性感染。ISG15是一种由Ⅰ型干扰素诱导机体产生的抗病毒蛋白,研究表明ISG15对一些病毒如人免疫缺陷病毒（HIV-1）、B型流感病毒等具有抗病毒作用。本实验室使用基因芯片技术检测猪瘟病毒感染猪只的外周血单个核细胞的基因转录谱的研究中,发现猪瘟病毒感染猪后1、3、6、9天采集的外周血淋巴细胞中ISG15基因mRNA分别呈2.63、4.51、4.43、2.18倍的变化。本研究的目的是为了进一步在蛋白水平上验证感染猪瘟病毒后细胞ISG15的表达变化,并探讨在宿主细胞中ISG15与猪瘟病毒之间的相互关系,为进一步探索猪瘟病毒的持续性感染的分子机制打下基础。本研究通过重组人Ⅰ型干扰素IFNα-2b诱导PK15细胞转录干扰素刺激基因,RT-PCR方法扩增ISG15基因,并克隆至pMD18-T载体上,再将ISG15基因亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1与真核表达载体pCDNA3.0。重组原核表达载体pGEX-ISG15转化BL21菌株,IPTG诱导表达ISG15重组蛋白,经过Ni-NTA树脂纯化重组蛋白,将纯化的ISG15重组蛋白与弗氏佐剂乳化免疫小鼠,制备ISG15多克隆抗体。重组真核表达载体pCDNA-ISG15用脂质体介导的方法转染PK-15细胞,用新霉素类抗生素G418筛选获得稳定表达ISG15蛋白的PK-15细胞系。通过制备的ISG15多克隆抗体,用间接免疫荧光与Western-blot方法检测猪瘟病毒感染PK-15细胞后的0、3、6、12、24、48、60 h的ISG15蛋白表达变化,ISG15蛋白在猪瘟病毒感染的PK-15细胞中表达增加,推测是ISG15蛋白介导的对猪瘟病毒蛋白的泛素化水解途径被猪瘟病毒阻断。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 干扰素刺激基因ISG15
• 1.2 ISG15蛋白的结构
• 1.3 ISG15的类泛素化修饰系统
• 1.4 ISG15与细胞内的蛋白
• 1.5 ISG15及其泛素化修饰系统的抗病毒作用
• 1.5.1 ISG15与流感病毒
• 1.5.2 ISG15与辛德毕斯病毒
• 1.5.3 ISG15与单纯疱疹病毒
• 1.5.4 ISG15与埃博拉病毒
• 1.5.5 ISG15与乙肝病毒、水泡型口炎病毒、淋巴脉络丛脑炎病毒
• 1.5.6 ISG15与丙肝病毒
• 1.5.7 ISG15与日本脑炎病毒
• 1.5.8 ISG15与冠状病毒
• 1.5.9 ISG15与人免疫缺陷病毒
• 1.6 猪瘟病毒对宿主细胞干扰素途径的调节作用
• 1.7 本研究的目的与意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要仪器与设备
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 实验试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 技术路线
• 2.2.2 引物设计
• 2.2.3 ISG15基因的克隆
• 2.2.4 ISG15原核与真核表达载体的构建
• 2.2.5 ISG15多克隆抗体的制备
• 2.2.6 ISG15稳定表达细胞系的构建
• 2.2.7 感染CSFV的PK-15细胞ISG15的表达状况
• 第三章 结果与分析
• 3.1 ISG15基因的克隆
• 3.2 ISG15基因原核与真核表达载体的构建
• 3.3 ISG15多克隆抗体的制备
• 3.3.1 原核表达载体pGEX-ISG15的表达
• 3.3.2 ISG15重组蛋白表达形式的鉴定
• 3.3.3 ISG15重组蛋白的Ni-NTA树脂亲和纯化
• 3.3.4 纯化的ISG15重组蛋白的鉴定
• 3.3.5 免疫后的多克隆血清与重组ISG15蛋白的反应性
• 3.3.6 ISG15多克隆抗体与PK-15细胞中ISG15蛋白的反应性
• 3.4 ISG15稳定表达细胞系的构建
• 3.4.1 ISG15真核表达载体转染PK-15细胞
• 3.4.2 IFA鉴定ISG15稳定表达的PK-15细胞系
• 3.4.3 Western-blot鉴定ISG15稳定表达的PK-15细胞系
• 3.5 CSFV与ISG15相互作用的初步探索
• 3.5.1 间接免疫荧光检测PK-15细胞感染CSFV病毒后ISG15的表达状况
• 3.5.2 Western-blot检测PK-15细胞感染CSFV病毒后ISG15的表达状况
• 第四章 讨论
• 4.1 ISG15原核表达的策略
• 4.2 重组蛋白的纯化
• 4.3 多克隆抗体的效价
• 4.4 稳定表达ISG15蛋白的PK-15细胞系的构建
• 4.5 CSFV感染PK-15细胞后ISG15表达
• 第五章 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢