猪心苹果酸脱氢酶的制备、酶学性质及应用研究

论文摘要

苹果酸脱氢酶（EC 1.1.1.37,MDH）是生物体三羧酸循环（TCA）的关键酶之一,它在柠檬酸循环中催化苹果酸形成草酰乙酸,也可以催化草酰乙酸形成苹果酸。MDH广泛存在于动物组织、细菌和植物中,在临床诊断中用于多酶分析及疾病的早期诊断,还可以用于食品中有机酸含量的测定,如L-苹果酸、醋酸、柠檬酸等物质的测定,具有广泛的应用前景。本文以猪心肌MDH为研究对象,以MDH的开发和应用为目标,在MDH的提取纯化、酶学性质、酶的稳定性以及酶的应用等方面进行了研究。以猪心为原料,采用组织破碎、二度硫酸铵盐析、Sephadex G-25凝胶过滤、DEAE Sepharose F.F.离子交换层析、Phenyl Sepharose 6 F.F.疏水层析及Sephadex G-75 Fine凝胶过滤的提纯步骤,分离得到MDH。提取纯化的MDH比酶活达1212.97 U/mg,纯化倍数达到122.64倍,酶活力回收率为53.64%。经过SDS-PAGE凝胶电泳,获得单一条带,达到电泳纯级别。以提取的酶为研究对象,对MDH的酶学性质和酶的稳定性进行了研究。来源于猪心肌MDH的最适作用温度为50℃,最适作用pH为8.0;在50℃以下,该酶有较好的稳定性,但是温度高于60℃时,酶活迅速降低;在pH 7.09.0范围内,酶活相对稳定,说明该酶有一定的耐碱性;其相对分子量约为69 kDa,含有2个亚基,每个亚基的相对分子量约为34 kDa;MDH对底物草酰乙酸OAA的米氏常数为84.6μmol/L （pH值8.3）。金属离子Ag+、Hg2+和Zn2+对酶活有强烈的抑制作用;而K+对酶有明显的激活作用;Ca2+和Mg2+对酶活没有明显影响;一些稳定剂对提高MDH的热稳定性有一定的作用,其中甘油的效果最好。利用MDH开发出一种测定葡萄酒中L-苹果酸的新方法。以制备的MDH和谷草转氨酶配成双酶反应体系,对葡萄酒中L-苹果酸的含量进行了测定;L-苹果酸含量的测定范围为0.0050.3 g/L,反应温度为25℃,检测波长为340 nm;通过标准样品和葡萄酒样品精密度及回收率（93.2%104%）实验,证明该方法适合葡萄酒中L-苹果酸含量的测定,且简单易行,准确可靠。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 苹果酸脱氢酶的催化特性、反应机理及其三维结构
• 1.1.1 苹果酸脱氢酶的催化特性
• 1.1.2 苹果酸脱氢酶的反应机理
• 1.1.3 苹果酸脱氢酶的三维结构
• 1.1.4 苹果酸天冬氨酸穿梭系统
• 1.2 苹果酸脱氢酶的来源及分布
• 1.3 苹果酸脱氢酶分离纯化的研究进展
• 1.4 苹果酸脱氢酶的实际应用价值
• 1.4.1 用于定量测定L-苹果酸
• 1.4.2 用于定量测定发酵液中的醋酸
• 1.4.3 用于定量测定发酵液中的柠檬酸
• 1.4.4 用作生产血清门冬氨酸氨基转移酶（AST）测定试剂盒的主要原料
• 2 的含量'>1.4.5 用于测定血清中总 CO₂的含量
• 1.5 课题研究意义及内容
• 第二章 猪心肌苹果酸脱氢酶制备工艺研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.1 原料
• 2.1.1.2 主要仪器
• 2.1.1.3 主要试剂
• 2.1.1.4 试剂配置方法
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 酶活测定方法
• 2.1.2.2 蛋白质浓度的测定
• 2.1.2.3 猪心MDH 粗酶液的制备
• 2.1.2.4 丙酮沉淀法与硫酸铵沉淀法
• 2.1.2.5 Sephadex G-25 Fine 凝胶过滤（φ1.6 cm×80 cm）
• 2.1.2.6 DEAE-Sepharose Fast Flow 阴离子交换层析（φ1.6 cm×30 cm）
• 2.1.2.7 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow 疏水层析（φ1.6 cm×30 cm）
• 2.1.2.8 Sephadex G-75 Fine 凝胶过滤（φ1.6 cm×80 cm）
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 匀浆缓冲液的选择与用量的确定
• 2.2.2 Bradford 法测定蛋白含量的标准曲线
• 2.2.3 丙酮分级沉淀与硫酸铵分级沉淀的效果比较
• 2.2.4 硫酸铵分级沉淀工艺条件的确定
• 2.2.5 Sephadex G-25 Fine 凝胶过滤
• 2.2.6 DEAE 离子交换层析对MDH 纯化效果的影响
• 2.2.7 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow 疏水层析
• 2.2.8 Sephadex G-75 Fine 凝胶过滤
• 2.3 本章小结
• 2.3.1 分离纯化总流程
• 2.3.2 纯化结果
• 2.3.3 展望
• 第三章 猪心肌苹果酸脱氢酶性质及稳定性研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 酶活测定方法
• 3.1.4 MDH 最适反应温度及热稳定性的测定
• 3.1.5 MDH 最适反应pH 及pH 稳定性的测定
• 3.1.6 MDH 的酶促反应动力学
• 3.1.7 金属离子对酶活力的影响
• 3.1.8 醇类对苹果酸脱氢酶的热稳定性的影响
• 3.1.9 MDH 的分子量的测定
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 最适反应温度及热稳定性
• 3.2.2 最适反应pH 及pH 稳定性
• 3.2.3 MDH 的酶促反应动力学
• 3.2.4 金属离子对酶活力的影响
• 3.2.5 MDH 的分子量的测定与双亚基推测
• 3.2.6 醇类对苹果酸脱氢酶的热稳定性的影响
• 3.2.7 不同稳定剂对MDH 存放稳定性的影响
• 3.3 本章小结
• 第四章 苹果酸脱氢酶在葡萄酒检测中的应用研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 葡萄酒中L-苹果酸的检测原理
• 4.1.3 L-苹果酸测定的操作方法
• 4.1.4 样品处理
• 4.1.5 回收率计算
• 4.1.6 精密度计算
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 测定葡萄酒中L-苹果酸方法的建立
• 4.2.2 标准样品中L-苹果酸的测定结果
• 4.2.3 MDH 测定葡萄酒中L-苹果酸的结果
• 4.3 本章小结
• 结论
• 展望
• 致谢
• 参考文献
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文