HCVc蛋白诱导胆管癌细胞上皮—间叶样表型转化及其分子机制的初步探讨

论文摘要

近年来,国内外大量流行病学和实验室研究发现,丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）感染与胆管癌发生关系密切。HCV核心区基因编码的核心蛋白（hepatitis C virus core protein,HCVc）,在细胞的信号转导、蛋白的相互作用、致癌及脂质代谢中起着重要作用,它可以通过激活NF-κB信号通路参与胆管癌的发生。上皮-间叶样表型转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是上皮细胞来源的恶性肿瘤的重要生物学现象,其实质是上皮细胞获得了成纤维细胞样表型,特征是细胞标志物改变和细胞内骨架重排,结果是细胞间粘附减弱、细胞运动能力大大增强。鉴于NF-κB信号通路在诱导EMT过程中的重要作用以及EMT可以促进肿瘤细胞的侵袭和转移,我们研究了HCVc蛋白与胆管癌细胞EMT的关联性,旨在证明HCVc蛋白可以诱导胆管癌EMT发生从而促进其侵袭和转移的可能性。赖氨酰氧化酶样2基因（lysyl oxidase-like 2 enzyme gene,LOXL2）是EMT的关键因子之一,由于其在胆管癌组织中存在着较高表达,并与胆管癌组织的分化、侵袭和转移密切相关,我们同时探讨了LOXL2在HCVc蛋白诱导胆管癌细胞EMT中的作用,旨在初步阐明胆管癌EMT的发生机理。为了检验我们的假想,本实验设计如下:首先,在胆管癌组织标本上,采用免疫组织化学的方法检测了HCVc蛋白、上皮性标志物（E-cadherin、α-catenin、β-catenin）、间叶性标志物（N-cadherin、vimentin、fibronectin）在胆管癌癌组织中的表达,并评价其临床意义;然后,转染含有HCVc全长基因序列的重组质粒载体到胆管癌细胞QBC939中,观察转染后细胞形态的变化,并检测细胞上皮性标志物、间叶性标志物及LOXL2的表达情况;最后,通过共转染HCVc基因和LOXL2 shRNA基因到QBC939中,检测转染后细胞上皮性标志物、间叶性标志物的表达变化情况,以评价LOXL2在HCVc蛋白诱导胆管癌细胞EMT中的作用。结果:1.34例胆管癌组织中HCVc蛋白的阳性表达率是47.1%,上皮性标志物的缺失率分别是E-cadherin 55.9%,α-catenin 70.6%,β-catenin 55.9%,间叶性标志物的阳性表达率分别是N-cadherin 50%,vimentin 44.1%,fibronectin 55.9%,HCVc蛋白的阳性表达与E-cadherin和α-catenin的缺失及N-cadherin、vimentin和fibronectin的阳性表达相关（P值均<0.05）,并与胆管癌组织的淋巴结及其它脏器转移具有相关性（P值均<0.05）。这些结果提示,HCVc蛋白可能通过诱导胆管癌组织上皮-间叶样表型转化的发生,促进了胆管癌的侵袭和转移。2.经过基因测序鉴定,PGST-HCVc195含有HCVc全长基因序列,质粒转染靶细胞后,RT-PCR及real-time PCR检测到HCVc mRNA的表达,免疫细胞化学和Western blotting检测到HCVc蛋白的表达。结果表明,HCVc基因成功地转染到胆管癌细胞QBC939中,目的基因得到高表达。3.重组质粒转染细胞5天后,空载体对照组细胞维持母细胞的上皮样表型,而表达HCVc基因的实验组细胞转化为梭形,变得离散;通过RT-PCR、real-time PCR、免疫细胞化学和Western blotting等方法进一步检测转染HCVc基因后胆管癌细胞标志物的表达变化,发现上皮性标志物E-cadherin在实验组细胞中的表达水平显著低于对照组细胞,同时间叶性标志物Vimentin、Fibronectin在实验组细胞中的表达明显高于对照组,这进一步提示,HCVc蛋白诱导胆管癌细胞发生了上皮-间叶样表型转化。4.细胞运动和侵袭实验结果显示,转染HCVc基因的实验组细胞运动和侵袭能力显著强于空载体对照组细胞,这提示,HCVc蛋白诱导胆管癌细胞发生上皮-间叶样表型转化后,提高了细胞的运动和侵袭能力。5.转染PGST-HCVc195重组质粒及PGEX-3ks空载体的实验组和对照组QBC939细胞48小时后,通过real-time PCR和Western blotting的方法检测LOXL2基因和蛋白的表达,结果显示:转染HCVc基因的实验组细胞LOXL2基因和蛋白的表达水平明显高于空载体对照组细胞,说明HCVc基因可能上调了LOXL2基因转录,增加了其蛋白的表达。6.经过酶切和基因测序鉴定,证明LOXL2 shRNA基因正确插入到所构建的重组质粒载体中,在其与HCVc基因共转染靶细胞后,荧光显微镜下实验组及对照组均可见绿色荧光蛋白的表达,通过real-time PCR和Western blotting的方法检测,发现两组细胞均有HCVc mRNA和蛋白的表达,同时,通过real-time PCR、免疫细胞化学和Western blotting的方法也检测到LOXL2 mRNA及蛋白的表达实验组明显低于空载体对照组,这说明,HCVc及LOXL2 shRNA基因成功地转染胆管癌细胞QBC939,目的基因得到较好的表达或沉默。7.重组质粒共转染细胞48小时后,通过real-time PCR和Western blotting的方法检测转染HCVc和LOXL2 shRNA基因后,胆管癌细胞标志物的表达变化,发现上皮标志物性E-cadherin在实验组细胞中的表达水平显著高于对照组细胞,而间叶性标志物Vimentin、Fibronectin在实验组细胞中的表达明显低于对照组,结果提示,LOXL2在HCVc蛋白诱导胆管癌细胞发生上皮-间叶样表型转化中发挥了重要作用。结论:1. HCVc蛋白可以诱导胆管癌细胞发生上皮-间叶样表型转化,其特征是胆管癌细胞形态由圆形、椭圆形、多角形,排列紧密,转化为梭形,离散;E-cadherin等上皮性标志物表达下调,Vimentin、Fibronectin等间叶性标志物表达增强,而且发生上皮-间叶样表型转化后,胆管癌细胞的运动和侵袭转移能力显著提高。2. LOXL2在HCVc蛋白诱导胆管癌细胞发生上皮-间叶样表型转化中发挥了重要作用。

论文目录

• 英文缩略词表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 HCVc 蛋白诱导胆管癌细胞上皮-间叶样表型转化及其分子机制的初步探讨
• 前言
• 第一部分 HCVc 蛋白与上皮性标志物和间叶性标志物在胆管癌组织的表达及其临床意义
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第一部分照片
• 第二部分 HCVc 基因在胆管癌细胞QBC939 中的表达及诱导细胞上皮-间叶样表型转化
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分照片
• 第三部分 LOXL2 在HCVc 蛋白诱导胆管癌细胞QBC939 上皮-间叶样表型转化中的作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分照片
• 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述 上皮-间叶样表型转化促进肿瘤侵袭和转移的分子机制研究进展
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的文章
• 英文论著