MEKK2相互作用蛋白的筛选

论文摘要

蛋白质相互作用的研究是阐释基因功能的重要手段。随着蛋白质组学的迅速发展,在不同生物体系中进行的大规模的蛋白质相互作用研究逐步成为生物学领域的一个重要方面。大多数细胞的生物学功能都是由蛋白复合体而非单一蛋白来完成的,所以识别和分析蛋白复合体的组分是研究蛋白功能所必需的。目前用于大规模研究蛋白质间相互作用最常用的方法是TAP和酵母双杂交。MEKK2是细胞中的有丝分裂原激酶家族一类丝/苏氨酸蛋白激酶,广泛分布于各组织中,其中脾脏和外周血细胞中表达高,提示MEKK2在免疫反应中有重要作用,而MEKK2在大部分组织中的功能不明确。MEKK2与多条信号通路有联系,能激活由MEK1/2,MEK3/6、MEK5介导的ERK,p38和ERK/BMK信号通路。还能激活转录因子NF-κB和AP-1,在激活PKC-2信号通路中也有重要作用。本文以全长MEKK2为诱饵,用酵母双杂交和TAP两种方法筛选MEKK2相互作用蛋白。酵母双杂交试验中,将MEKK2克隆到pGBKT7载体中,与293细胞和B细胞文库通过PEG/LiAC法共转化到酵母细胞中,通过营养缺陷培养基筛选阳性克隆。结果显示4-平板出现约2000个克隆,表明这种方法不适合筛选全长MEKK2相互作用蛋白。TAP试验中,选用SBP和CBP标签。将MEKK2克隆到pCTAP载体中后与pSUPER空载体共转染HEK293细胞,使用嘌呤霉素建立稳定细胞系,通过两步亲和纯化得到一蛋白复合物。经质谱鉴定,该蛋白复合物含216个蛋白。经肽段比较和结构分析确定,Mip1、MEK3、MEK6为已知相互作用蛋白,50个为非特异蛋白,另外的163个为可能相互作用蛋白。该研究结果为以后探讨MEKK2的激活机制及深入研究MEKK2的生物学功能奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 MEKK2概述
• 2 筛选相互作用蛋白方法
• 2.1 酵母双杂交
• 2.2 串联亲和纯化
• 2.3 蛋白质芯片技术
• 2.4 基于生物信息学的分析方法
• 2.5 其他方法
• 3 质谱在蛋白质相互作用分析中的应用
• 4 本研究的目的与意义
• 第二章 酵母双杂交筛选MEKK2相互作用蛋白
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR产物鉴定
• 2.2 pGBKT7-MEKK2重组质粒的鉴定
• 2.3 酵母双杂交筛选结果
• 3 讨论
• 3.1 酵母双杂交转化效率
• 3.2 酵母双杂交筛选
• 3.3 酵母双杂交的优点与缺点
• 第三章 串联亲和纯化（TAP）筛选MEKK2相互作用蛋白
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR产物的鉴定
• 2.2 pCTAP-MEKK2酶切鉴定
• 2.3 pCTAP-MEKK2在HEK293细胞中表达
• 2.4 稳定细胞系表达
• 2.5 TAP纯化电泳鉴定
• 2.6 纯化蛋白复合物银染鉴定
• 2.7 纯化蛋白复合物质谱鉴定
• 3 讨论
• 3.1 TAP技术的标签
• 3.2 稳定转染建立细胞系
• 3.3 质谱鉴定
• 3.4 TAP技术的优点与弊端
• 3.5 TAP技术的应用
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录