论文摘要
目的:1.建立丹皮水煎剂、大黄牡丹汤的制备方法,及其中丹皮酚含量HPLC-UV测定方法。2.采用HPLC-UV法测定人血浆中丹皮酚浓度,进行中国健康志愿者单次口服160mg丹皮酚片的人体药代动力学研究,了解其人体吸收、分布及消除规律。3.进行中国健康志愿者进食和禁食单次口服160mg丹皮酚片的人体药代动力学研究,了解进食对丹皮酚吸收、分布、消除体内过程的可能影响,为制定科学、合理的丹皮酚临床给药方案提供依据。4.采用HPLC-UV法测定小鼠血浆中丹皮酚浓度,比较丹皮酚片、丹皮水煎剂及大黄牡丹汤中丹皮酚在小鼠体内的药代动力学特征,研究原药材、组方药中其他成分对丹皮酚吸收、分布、体内消除的影响。方法:1.牡丹皮生药（安徽铜陵）24g,300mL纯净水冷浸12h,加热煮沸,保持微沸20min,收集滤液;药渣加入200mL纯净水,加热煮沸,保持微沸10min,收集滤液,两次滤液合并。采用XB-C18（250mm×4.6mm,5μm）色谱柱,甲醇-醋酸-水（69:1:30,V/V/V）为流动相,1mL/min流速,274nm紫外检测波长。大黄牡丹汤（大黄3g,丹皮12g,桃仁9g,冬瓜仁30g,芒硝9g）两副,大黄6g,丹皮24g,桃仁18g,冬瓜仁60g,300mL纯净水冷浸12h,加热煮沸,保持微沸15min,而后下入芒硝18g,保持微沸5min,收集滤液;药渣加入150mL纯净水,加热煮沸,保持微沸10min,收集滤液;两次滤液合并。采用XB-C18（250mm×4.6mm,5μm）色谱柱,流动相为甲醇-醋酸-水（68:2:30,V/V/V）;流速为0.9mL/min,紫外检测波长为274nm。2.24名健康志愿者于试验前一天晚10时后禁食,空腹口服丹皮酚片160mg,服药4小时后进食。于服药前和服药后0.25,0.5,0.75,1,1.25,1.5,1.75,2,2.25,2.5,2.75,3h取肘静脉血4mL,移入肝素化试管中,3500r/min离心15min。取血浆0.5mL,加入0.3mL乙腈,涡旋混匀,10080r/min高速离心5min,上清液转入含50～60mg NaCL的1.5mL离心管,简单涡旋并室温放置10min,10080r/min高速离心5min,取上清液。采用为XB-C18（250mm×4.6mm,5μm）色谱柱,流动相为四氢呋喃-甲醇-水-磷酸（6:60:34:0.1,V/V/V/V）,流速为1mL/min,紫外检测波长为274nm,50μL进样。采用DAS2.0药代动力学程序计算丹皮酚在健康人体内药代动力学参数。3.6名健康志愿者随即分为2组,按照两种处理（禁食和进食）双周期交叉实验设计,分别禁食、进食后口服160mg丹皮酚片,于服药前和服药后0.25,0.5,0.75,1,1.25,1.5,1.75,2,2.25,2.5,2.75,3h取肘静脉血4mL,移入肝素化试管中,3500r/min离心15min。取血浆0.5mL,加入0.3mL乙腈,涡旋混匀,10080r/min高速离心5min,上清液转入含50～60mg NaCL的1.5mL离心管,简单涡旋并室温放置10min,10080r/min高速离心5min,取上清液。采用为XB-C18（250mm×4.6mm,5μm）色谱柱,流动相为四氢呋喃-甲醇-水-磷酸（6:60:34:0.1,V/V/V/V）,流速为1mL/min,紫外检测波长为274nm,50μL进样。采用DAS 2.0药代动力学程序计算两组丹皮酚药代动力学参数并进行方差分析,评价进食对丹皮酚药代动力学参数的影响。4.22～28g雄性小鼠180只,随机分为3组,即丹皮酚片组、丹皮水煎剂组、大黄牡丹汤组,按10mg/Kg丹皮酚剂量灌胃给药,于给药前和给药后5,7,10,15,20,25,30,35,40,50,60min摘眼球取血至肝素化的离心管中,4000r/min离心5min,取0.2mL血浆加入0.2mL乙腈,简单涡旋,10080r/min高速离心5min,上清液转入含有40～50mg NaCL的离心管中,室温放置15min,10080r/min离心5min,取上清。选用XB-C18（250mm×4.6mm,5μm）色谱柱,流动相采用乙腈:水（含0.1%磷酸和1%四氢呋喃）比例为（60:40,V/V）,流速为1mL/min,紫外检测波长为274nm,20μL进样。检测各个时间点血药浓度,采用DAS 2.0药代动力学程序计算小鼠分别灌胃三组药液后,丹皮酚在小鼠体内的药代动力学参数并进行双单侧t检验和方差分析,研究丹皮原药材其他成分和复方药大黄牡丹汤中其他组分中对丹皮酚体内过程的影响。结果:1.HPLC-UV法测得丹皮水煎剂中丹皮酚含量约为1.5mg/mL,大黄牡丹汤中丹皮酚含量约为0.3mg/mL。2.HPLC-UV法测定健康志愿者血浆中丹皮酚浓度,在10～500ng/mL范围内线性关系良好,回归方程为Y=-11652.36607+5207.71572X,（r=0.9998）,最低定量限为10ng/mL,绝对回收率为84.86%～86.13%,相对回收率为92.28～97.44%,日内、日间RSD均小于13.72%,-20℃冷冻24h及7天稳定,RSD均小于10.46%,反复冻融稳定,RSD均小于8.4%。口服丹皮酚片（160mg）后丹皮酚主要药代动力学参数半衰期t1/2为1.09±0.62h,达峰时Tmax为1.03±0.15h,峰浓度Cmax为111.16±41.24ng/mL,血药浓度-时间曲线下面积AUC0-t为171.26±42.63ng·h/mL,AUC0-∞为220.27±67.24ng·h/mL。3.进食和禁食两组健康志愿者单剂量单次口服丹皮酚片（160mg）后丹皮酚主要药代动力学参数半衰期t1/2分别为1.01±0.67h和1.97±1.12h;达峰时Tmax分别为1.87±0.38h和1.04±0.10h;峰浓度Cmax分别为57.77±3.75ng/mL和77.69±25.80ng/mL;血药浓度-时间曲线下面积AUC0-t分别为89.95±7.78ng·h/mL和132.05±46.44ng·h/mL;AUC0-∞分别为125.97±23.39ng·h/mL和199.95±71.70ng·h/mL。4.三组小鼠分别灌胃含同等剂量丹皮酚（10mg/kg）的丹皮酚片溶液、丹皮水煎剂、大黄牡丹汤后,丹皮酚小鼠主要药代动力学参数t1/2分别为13.15±2.48min、15.04±4.40min和21.83±6.21min;达峰时Tmax分别为15min、15 min和10 min;峰浓度Cmax分别为69.41±4.50 ng/mL、82.90±6.10ng/mL和123.32±5.55 ng/mL;血药浓度-时间曲线下面积AUC0-t分别为1243.42±109.751 ng·min/mL、1412.74±97.723ng·min/mL和2162.198±105.1ng·min/mL;AUC0-∞分别为2192.456±472.182 ng·min/mL、2659.571±1590.703 ng·min/mL和3423.361±465.409ng·min/mL。结论:1.丹皮水煎剂和大黄牡丹汤中丹皮酚浓度分别为1.5mg/mL和0.3mg/mL。2.建立HPLC-UV法测定健康志愿者体内丹皮酚血药浓度,特异性强,可用于丹皮酚血浓度测定。丹皮酚在健康人体内药代动力学参数与小鼠、家兔等有一定差异,可根据人体的主要药代动力学参数调整给药剂量、给药次数等,指导临床用药。3.进食组Tmax从1.04±0.10h.延长到1.87±0.38h,t1/2从1.97±1.12h.减少到1.01±0.67h,Cmax从77.69±25.80ng/mL减少到57.77±3.75ng/mL,AUC0～t从132.05±46.44ng·h/mL减少到89.95±7.78ng·h/mL,AUC0-∞从199.95±71.70ng·h/ml减少到125.97±23.39ng·h/mL。提示进食后可使Tmax明显延长,t1/2、AUC、Cmax显著减少,可用于指导丹皮酚口服制剂的临床应用。4.小鼠分别灌胃含同等丹皮酚剂量（10mg/kg）的丹皮酚单体、丹皮水煎剂、大黄牡丹汤,HPLC-UV法测定小鼠体内丹皮酚血药浓度,计算三组小鼠丹皮酚药代动力学参数,并进行双单侧t检验和方差分析。结果显示,丹皮酚单体和丹皮水煎剂,丹皮酚单体和大黄牡丹汤、丹皮水煎剂和大黄牡丹汤则有显著性差异。提示丹皮原药材中其他成分和大黄牡丹汤中其他组分可影响丹皮酚的吸收,丹皮酚达峰时间明显提前,峰浓度和曲线下面积显著增大。