马铃薯脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）基因在番茄中超表达效应的研究

论文摘要

抗坏血酸（L-ascorbic acid, AsA）即维生素C,是一种普遍存在于植物组织的小分子抗氧化物质,在生物体中具有重要的代谢功能和抗氧化作用。AsA是人类必需的重要维生素,由于人体缺乏合成AsA的能力,必须从食物中获得,而植物为人类提供了主要的抗坏血酸来源。抗坏血酸及其代谢相关酶类能够清除环境胁迫产生的活性氧,从而在植物抵抗环境胁迫中起着重要作用。通过调控植物抗坏血酸生物合成与代谢相关酶基因的表达,可以提高抗坏血酸的含量,从而增加植物产品的营养价值,增强植物对逆境胁迫的抗性。脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）是植物抗坏血酸-谷胱甘肽循环中的关键酶,催化还原态谷光甘肽还原脱氢抗坏血酸（DHA）,使DHA还原为还原态的抗坏血酸。本研究将马铃薯的DHAR两个同工酶基因DHAR1,DHAR2导入番茄使其超表达,研究其在番茄AsA代谢及逆境胁迫下的功能。主要结果如下:1.将马铃薯DHAR1和DHAR2正义表达载体,利用农杆菌介导转化番茄。通过PCR及荧光定量PCR的方法对带卡那抗性的转基因植株检测,结果证明成功获得了转正义DHAR1和DHAR2基因的番茄植株。2. DHAR1超表达的转基因植株叶片和果实的DHAR活性、AsA含量及AsA/DHA均比野生型显著增加。DHAR2超表达的转基因植株叶片的DHAR活性、AsA含量及AsA/DHA显著增加,但果实中上述指标没有显著变化,表明DHAR2仅在含叶绿体的器官中表达,其在叶片中的超表达未影响果实DHAR活性和AsA含量。3. DHAR1和DHAR2的超表达均能提高番茄叶片中叶绿素含量和叶片光合速率。说明DHAR的超表达对稳定植株叶绿素,增强光合作用有重要作用。4.超表达DHAR1,DHAR2基因植株对盐胁迫和甲基紫精胁迫的抗性有一定程度的提高。在盐胁迫条件下,超表达DHAR1,DHAR2基因植株与野生型植株相比,具有更高的发芽率,株高,茎长和叶绿素含量。在高浓度甲基紫精氧化胁迫下,转基因植株叶盘坏死现象少于野生型植株,叶绿素含量比野生型更高。低温处理条件下,与野生型植株相比,超表达DHAR1基因番茄叶片的DHAR活性、AsA和叶绿素含量提高,细胞质膜透性、膜脂过氧化产物MDA含量降低。超表达DHAR1的转基因植株抗冷性有一定程度的提高。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1. 引言
• 1.1 AsA在植物体内的生理功能
• 1.1.1 作为一些酶的辅酶
• 1.1.2 参与植物抗氧化系统
• 1.1.3 参与光合作用和光保护
• 1.1.4 调控细胞壁代谢和细胞膨大
• 1.1.5 促进细胞分裂和植物生长发育
• 1.2 高等植物中AsA的合成
• 1.3 高等植物中AsA的氧化还原
• 1.4 高等植物中AsA的转运
• 1.5 植物抗坏血酸合成代谢关键酶
• 1.5.1 L-半乳糖-1, 4-内酯脱氢酶（GalLDH）
• 1.5.2 抗坏血酸过氧化物酶（APX）
• 1.5.3 单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）
• 1.5.4 脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）
• 1.6 抗坏血酸与环境胁迫
• 1.6.1 低温胁迫
• 1.6.2 高温胁迫
• 1.6.3 干旱胁迫
• 1.6.4 盐胁迫
• 1.7 本研究的目的和意义
• 2. 材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株及质粒
• 2.1.3 材料处理
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 农杆菌介导转化番茄
• 2.2.1.1 农杆菌菌液准备
• 2.2.1.2 番茄再生植株的获得
• 2.2.2 转基因番茄植株PCR检测
• 2.2.2.1 CTAB法微量法提取基因组DNA
• 2.2.2.2 转基因植株的PCR筛选
• 2.2.3 DHAR1、DHAR2基因表达量测定
• 2.2.3.1 RNA提取
• 2.2.3.2 荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR）
• 2.2.4 转基因番茄生理指标的测定
• 2.2.4.1 L-半乳糖-1，4-内酯脱氢酶（GalLDH）活性测定
• 2.2.4.2 DHAR、MDHAR和APX酶活性测定
• 2.2.4.3 AsA和DHA含量
• 2.2.4.4 生长指标
• 2.2.4.5 叶绿素含量
• 2.2.4.6 光合速率与叶绿素荧光参数
• 2.2.4.7 可溶性糖和有机酸
• 2.2.4.8 丙二醛（MDA）含量
• 2.2.5 转基因番茄植株抗氧化逆境初步分析
• 2.2.5.1 转基因番茄耐盐性试验
• 2.2.5.2 叶片失水试验
• 2.2.5.3 叶片甲基紫精处理试验
• 2.2.5.4 转DHAR1基因番茄抗冷性
• 3. 结果与分析
• 3.1 番茄再生植株的获得
• 3.2 转基因番茄植株的分子检测
• 3.2.1 转基因番茄植株PCR检测
• 3.2.2 转基因番茄植株DHAR基因表达量
• 3.3 DHAR1，DHAR2基因在番茄中的超表达效应
• 3.3.1 转基因植株不同叶位的DHAR活性和叶绿素含量变化
• 3.3.2 转基因植株的DHAR活性
• 3.3.3 转基因植株的抗坏血酸含量
• 3.3.4 转基因植株的MDHAR、APX和GalLDH的活性
• 3.3.5 转基因番茄植株表型差异
• 3.3.5.1 转基因对番茄植株叶绿素含量和光合速率的影响
• 3.3.5.2 转基因对番茄植株叶绿素荧光参数的影响
• 3.3.5.3 转基因对番茄植株生长的影响
• 3.3.5.4 转基因对番茄植株产量的影响
• 3.3.5.5 转基因对番茄植株可溶性糖、有机酸含量及糖酸比的影响
• 3.3.6 转基因番茄植株抗逆性研究
• 3.3.6.1 转基因番茄植株耐盐性
• 3.3.6.2 转基因番茄植株叶片甲基紫精处理
• 3.3.6.3 转基因番茄植株的离体叶片失水率
• 3.3.6.4 转DHAR1基因番茄抗冷性
• 3.3.6.4.1 低温胁迫下番茄叶片DHAR活性
• 3.3.6.4.2 低温胁迫下番茄叶片中AsA、DHA和AsA+DHA含量的变化
• 3.3.6.4.3 低温胁迫下番茄叶片叶绿素、电导率和MDA含量的变化
• 4. 讨论
• 4.1 DHAR1和DHAR2超表达与番茄DHAR活性和AsA含量的关系
• 4.2 DHAR1和DHAR2超表达与抗坏血酸代谢系统的关系
• 4.3 DHAR1和DHAR2超表达与光合速率、叶绿素含量和生长及品质的关系
• 4.4 DHAR1和DHAR2超表达与番茄抗逆性的关系
• 5. 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况
• 硕士学位论文内容简介及自评