拟南芥细胞自噬相关基因的荧光素酶互补检测研究

论文摘要

细胞自噬是植物体内极其重要的功能之一。拟南芥细胞自噬相关基因的研究对深入了解细胞自噬具有重要意义。Atg8是细胞自噬的一个重要蛋白,Atg8融合GFP是检测植物中细胞自噬的重要途径。在前期的研究中,我们以AtAtg8e为诱饵蛋白,通过酵母双杂交实验,从拟南芥cDNA文库筛选得到了35个与AtAtg8e互作的蛋白。本研究采用荧光素互补技术（LCI）进一步探讨这些蛋白在烟草中与AtAtg8的互作关系。首先构建了LCI所需的载体：35个候选基因以及AtAtg8的N-LUC载体；AtAtg8 （a-i）等9个基因的C-LUC载体。随后进行LCI检测,发现在检测的35个候选蛋白中,只有2个蛋白（E58和E121）荧光强烈；7个蛋白（E13、E16、E20、E52、E89、E116和E134）荧光强度中等；大部分的蛋白没有荧光或信号很弱。说明E58和E121蛋白在烟草体内与AtAtg8e互作强烈；E13、E16、E20、E52、E89、E116和E134蛋白与AtAtg8e有互作,但相对较弱。另外,发现E58和E121蛋白与9个AtAtg8蛋白互作强度有差异,说明AtAtg8家族中各成员的功能可能有所不同。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1 植物细胞自噬的含义、分类
• 1.1 植物细胞自噬的含义
• 1.2 植物细胞自噬的分类
• 2 酵母的细胞自噬通路
• 2.1 酵母的细胞自噬基因
• 2.2 两个泛素化体系
• 2.2.1 Atg8-PE体系
• 2.2.2 Atg12-Atg5体系
• 2.3 细胞自噬的形成和加工
• 3 植物中的Atg基因
• 4 植物细胞自噬的研究方法
• 4.1 细胞自噬蛋白Atg8的标记
• 4.2 细胞自噬抑制剂的应用
• 4.3 衰老相关液泡
• 5 植物细胞自噬的生理功能
• 5.1 细胞自噬突变体与环境胁迫
• 5.2 细胞自噬与叶绿体的降解
• 5.3 细胞自噬与氧化胁迫
• 5.4 细胞自噬与程序性细胞死亡
• 5.5 细胞自噬与病原菌侵染
• 5.6 细胞自噬与植物激素
• 5.6.1 细胞自噬与水杨酸
• 5.6.2 细胞自噬与茉莉素
• 6 荧光素酶互补技术
• 7 本课题的研究目的与意义
• 第二章 荧光素酶互补检测蛋白的相互作用
• 1 试验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 酶与试剂盒
• 1.3 菌株与质粒
• 1.4 培养基
• 1.5 抗生素
• 1.6 酶制剂
• 2 实验方法
• 2.1 核酸的提取
• 2.1.1 DNA的提取
• 2.1.2 RNA的提取
• 2.1.3 测定RNA浓度的OD260及OD260/OD280值
• 2.1.4 检测RNA质量
• 2.1.5 质粒DNA的提取
• 2.2 反转录
• 2.3 PCR反应
• 2.3.1 phusion酶PCR反应体系
• 2.3.2 phusion酶PCR反应程序
• 2.3.3 普通Taq酶的PCR反应体系
• 2.3.4 普通Taq酶的PCR反应程序
• 2.4 片段的纯化
• 2.4.1 DNA片段纯化
• 2.4.2 乙醇沉淀PCR产物
• 2.4.3 酶切产物的纯化
• 2.5 大肠杆菌感受态的制备及转化
• 2.5.1 大肠杆菌感受态的制备
• 2.5.2 热激法转化大肠杆菌
• 2.6 农杆菌感受态的制备与转化
• 2.6.1 农杆菌感受态的制备
• 2.6.2 电击法转化农杆菌
• 2.7 荧光素互补技术
• 2.7.1 荧光互补试验试剂配制
• 2.7.2 本生烟叶片注射方法
• 2.7.3 荧光素显微镜使用方法
• 3 结果与分析
• 3.1 C-LUC/N-LUC相关载体的克隆与鉴定
• 3.2 荧光素互补试验
• 5 讨论
• 5.1 酵母双杂交和荧光素酶互补技术
• 5.2 与AtAtg8e互作的蛋白
• 结论
• 参考文献
• 附录A: 缩略词表
• 附录B: 主要试剂配置
• 附录C: 用于载体构建的相关引物
• 附录D: C-LUC载体图谱
• 附录E: C-LUC载体图谱
• 致谢
• 作者简历