利用酵母双杂交系统筛选与ARIP5相互作用的蛋白质

论文摘要

激活素属于转化生长因子β超家族,是一种多功能生长分化因子,其作用具有明显的组织特异性。在激活素的信号转导通路中,由于Smads家族蛋白无法解释激活素作用的组织特异性,从而开始研究激活素受体相互作用蛋白（ARIPs）的作用。ARIPs的成员ARIP1-5在其N端均可以与激活素Ⅱ型受体发生作用,因此要研究激活素的不同信号通路的关键就在于其C端作用的阐明。酵母双杂交系统是检测蛋白质与蛋白质之间相互作用发生与否的行之有效的一种实验手段。为了进一步研究ARIP5在激活素细胞信号转导中的作用,我们利用酵母双杂交系统,以pGBK-ARIP5作为“诱饵”质粒,对cDNA表达文库进行了筛选,得到了 50个阳性克隆,从阳性克隆的酵母菌株中提取质粒并转化大肠杆菌TOP10,之后在含氨苄青霉素的抗性平板上筛选,对阳性克隆的插入片段进行测序并将测序结果分析。应用酵母双杂交系统筛选到的与ARIP5相互作用的蛋白,可以完善激活素的信号转导通路的网络,从而为进一步研究激活素的功能提供理论依据,并为与激活素有关的疾病的治疗提供一条新的途径。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 引言
• 一 酵母双杂交系统（Yeast Two-Hybrid System）
• （一） 酵母双杂交系统概述
• （二） 酵母双杂交系统的形式
• （三） 酵母双杂交系统的特点
• （四） 酵母双杂交系统的应用及发展
• 二 激活素受体相互作用蛋白（Activin Receptor Interacting Proteins,ARIPs）
• 第二部分 实验材料与方法
• 一 实验材料
• （一） 质粒及菌种
• （二） 试剂及试剂盒
• （三） 主要试剂和缓冲液
• （四） 主要仪器与设备
• （五） 聚合酶链式反应（PCR）引物
• 二 实验方法
• （一） pGBK-ARIP5重组子的鉴定
• （二） pGBK-ARIP5重组子的蛋白表达及鉴定
• （三） 酵母双杂交筛选与pGBK-ARIP5相互作用的蛋白
• 第三部分 实验结果与分析
• 一 pGBK-ARIP5重组子的鉴定
• （一） PCR法验证pGBK-ARIP5重组子
• （二） 测序验证pGBK-ARIP5重组子
• 二 pGBK-ARIP5重组子的蛋白表达及鉴定
• 三 酵母双杂交系统筛选与pGBK-ARIP5相互作用的蛋白
• （一） pGBK-ARIP5重组子的毒性及自激活作用验证
• （二） 人cDNA文库的滴度测定、扩增及纯化
• （三） 酵母双杂交筛选人cDNA表达文库
• （四） 质粒PCR验证阳性克隆的插入片段
• （五） 阳性克隆插入片段的序列分析
• 第四部分 讨论
• 第五部分 结论
• 参考文献
• 致谢