鸡蛋胆固醇营养效果及其脂质调控成分筛选与机理研究

论文摘要

针对鸡蛋胆固醇其营养作用目前仍有争议的现状,本文以鸡蛋及其活性成分作为研究对象,开展了鸡蛋胆固醇营养动物实验、鸡蛋调控胆固醇活性成分的筛选及鸡蛋活性脂质调控胆固醇吸收代谢的机理研究等系列工作。主要的研究内容和主要研究成果摘要如下：本实验以健康Sprague Dawley大鼠为动物模型,摄入同等胆固醇含量的化学胆固醇（CLG）、蛋黄（EYG）、全蛋（WEG）及不含胆固醇的普通饲料（CCG）进行饮食干预90d,系统检测胆固醇及其代谢物在大鼠体内各脏器、血液及粪便中的含量,通过肝脏切片观察病变,运用RT-qPCR检测胆固醇相关代谢酶的转录水平表达。实验结果发现EYG组与WEG组大鼠的身体状况、血脂、肝脂等与CCG组相比无显著差异,但与CLG组相比较,其肝脏TG、TC及LDL-胆固醇,肝脏TG与TC,肝脏损伤程度,肝脏羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMG-CoAR）与酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶（ACAT）的mRNA表达量都显著性地降低；而肝脏HDL-胆固醇与TBA,粪便中性固醇与TBA,肝脏低密度脂蛋白受体（LDLr）、胆固醇-7α羟化酶（CYP7A1）与卵磷脂-胆固醇酰基转移酶（LCAT）的mRNA表达量均显著性地升高。实验结果表明鸡蛋对健康SD大鼠血脂无显著性影响,鸡蛋的摄入能显著抑制胆固醇体内从头合成及以胆固醇酯的形式在体内储存,促进了胆固醇向胆汁酸的转化,并随粪便排出。建立了体外Caco-2细胞单层吸收模型,并从形态学、酶学、跨膜电阻及通透率对其进行评估。实验结果发现经过21d培养的Caco-2细胞可以作为小肠吸收的体外模型,倒置显微镜与电镜检查,发现细胞单层模型的A侧分化形成微绒毛与细胞间形成了完整的紧密连接结构,细胞单层模型的跨膜电阻值均符合220Ω·cm2-600Ω·cm2（?）勺要求,细胞单层的标志性酶（碱性磷酸酶）活力增加表现出明显的极化,荧光黄A-B侧转运的渗透系数低于转运实验规定的1.0×10-6cm/s。上述结果表明建立的Caco-2细胞单层模型符合物质转运实验的条件,可以作为胆固醇吸收转运研究的体外模型。以Caco-2细胞单层为模型,研究了一系列浓度的胆固醇在不同pH值下的双向转运情况,以及NPC1L1蛋白抑制剂依折麦布（Eetimibe）对胆固醇细胞转运的影响。实验结果发现,胆固醇在Caco-2细胞单层模型中的转运表现为一定的浓度与pH值依赖性和饱和性,在胆固醇添加浓度为100μmol/L供液pH值为7.4条件下,胆固醇在Caco-2细胞单层模型中的转运渗透系数最高,其摄入比为4.73,胆固醇在Caco-2细胞单层吸收过程中受到载体转运蛋白的调节,而胆固醇外排是以被动扩散的方式转运。当加入Ezetimibe （10μmol/L）之后胆固醇摄入比显著降低。实验结果说明胆固醇在Caco-2细胞单层模型中的转运为载体蛋白NPC1L1介导的主动转运。以Caco-2细胞单层为模型,提取鸡蛋中脂质、蛋白质类组分,借助体外人工胃肠模拟消化系统,采用液体闪烁追踪3-H-胆固醇,研究各组分对胆固醇在Caco-2细胞单层模型中摄取与转运的影响。实验结果发现,鸡蛋中的蛋白质（蛋清总蛋白质、蛋黄总蛋白质及卵黏蛋白）、磷脂（卵磷脂与神经鞘磷脂）及n-3系列的多不饱和脂肪酸（EPA与DHA）能显著地抑制Caco-2细胞中胆固醇的摄取与转运,棕榈酸与溶血卵磷脂能够促进Caco-2细胞中胆固醇的摄取与转运,而单不饱和脂肪酸与脑磷脂对Caco-2细胞中胆固醇的摄取与转运无显著性影响。上述结果表明鸡蛋中含有调控胆固醇吸收转运的成分,为进一步揭示其对胆固醇代谢网络的调控及机制提供理论基础。考察鸡蛋各磷脂成分对胆固醇微胶束化学组成、牛磺胆酸钠结合能力、微胶束中胆固醇与牛磺胆酸盐的溶解能力及微胶束分子量变化的影响。实验结果发现,蛋黄卵磷脂与神经鞘磷脂的添加促进了胆固醇参与微胶束的形成,且随着添加量的增加使得牛磺胆酸钠的结合能力增强。当微胶束孵育24h后,蛋黄卵磷脂与神经鞘磷脂组的盐溶液中胆固醇溶解度显著地低于其他组,蛋黄神经鞘磷脂组的牛磺胆酸钠的溶解度显著性降低。此外,微胶束的分子量随着蛋黄卵磷脂与神经鞘磷脂添加浓度的增加而增加,表明微胶束释放的速度受到了这两种磷脂的约束,减慢了微胶束中胆固醇通过静止水层向肠上皮细胞转运前的释放过程。以上结果表明鸡蛋卵磷脂与神经鞘磷脂通过改变胆固醇混合微胶束的物理化学性质,在一定程度上抑制了微胶束向小肠上皮细胞的转运过程。通过RT-qPCR与Western-blot检测不同浓度鸡蛋卵磷脂与神经鞘磷脂对Caco-2细胞胆固醇吸收通路中关键蛋白转录与翻译水平表达的影响。实验结果发现鸡蛋卵磷脂与神经鞘磷脂均能显著性抑制小肠胆固醇吸收关键蛋白NPC1L1（尼曼-匹克C1型类似蛋白1）的转录与翻译,从而抑制胆固醇在Caco-2细胞中的摄入与转运。鸡蛋卵磷脂与神经鞘磷脂对于NPC11L基因与蛋白表达的抑制可能与转录因子SREBP（固醇调节元件结合蛋白）激活受到抑制相关。鸡蛋卵磷脂通过促进胆固醇合成HDL的方式移除Caco-2细胞中多余的胆固醇。此外,高浓度的蛋黄神经鞘磷脂有可能通过下调Caveolin1基因表达从而抑制胆固醇的吸收。通过RT-qPCR与Western-blot检测鸡蛋中六种脂肪酸（PA、OA、LA、AA、EPA、 DHA）对Caco-2细胞胆固醇吸收通路中关键蛋白转录与翻译水平表达的影响。实验结果发现EPA与DHA均能显著性抑制小肠胆固醇吸收关键蛋白NPC1L1的转录与翻译,从而抑制胆固醇在Caco-2细胞中的摄入与转运,而高浓度的PA与OA通过促进NPC1L1基因的转录表达使得胆固醇在Caco-2细胞中的摄入与转运增加,且NPCL1L基因的下调与转录因子SREBP受到抑制相关。高浓度的AA与EPA通过抑制ABCA1（三磷酸腺苷结合盒转运体A1）的活性,从而抑制Caco-2细胞中胆固醇以合成HDL的方式外排,而高浓度的PA与OA通过上调ACAT2的转录表达促进胆固醇转化为胆固醇酯最终参与乳糜微粒的形成。一定浓度的EPA与DHA抑制了Caveolin1mRNA的表达,表明EPA与DHA有可能通过下调Caveolin1基因表达抑制胆固醇的吸收。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 绪论
• 1 鸡蛋中胆固醇的存在形式与类型
• 2 胆固醇小肠吸收的遗传调控
• 2.1 胆固醇小肠吸收的生理过程
• 2.2 胆固醇小肠吸收效率的遗传因素变异
• 2.3 胆固醇小肠吸收效率的影响因素
• 2.4 胆固醇小肠吸收效率的测定
• 3 胆固醇细胞代谢的遗传调控
• 3.1 胆固醇生物合成
• 3.2 胆固醇动态平衡的转录调控
• 3.3 胆固醇酯化及胆固醇酯的水解
• 3.4 胆固醇代谢产物
• 3.4.1 胆汁酸
• 3.4.2 羟化固醇衍生物
• 3.4.3 类固醇激素
• 4 鸡蛋摄取与血胆固醇的关系
• 4.1 胆固醇饮食-心血管疾病假说的提出
• 4.2 鸡蛋胆固醇营养作用争议的产生与持续
• 4.3 鸡蛋胆固醇营养作用争议产生后的新发现
• 5 鸡蛋中调控胆固醇吸收代谢的成分
• 5.1 鸡蛋中的蛋白质与氨基酸
• 5.1.1 鸡蛋中个别氨基酸影响胆固醇代谢
• 5.1.2 鸡蛋蛋白质对体内胆固醇合成代谢的影响
• 5.2 蛋黄中的脂质与脂蛋白
• 5.2.1 蛋黄中不饱和脂肪酸的协调作用
• 5.2.2 叶黄素的抗氧化作用
• 5.2.3 蛋黄中的脂蛋白
• 5.3 蛋黄中的磷脂
• 5.3.1 过量磷脂干扰微胶束中磷脂的有效水解
• 5.3.2 过量磷脂改变混合微胶束的物理化学性质
• 5.3.3 磷脂直接作用于肠上皮细胞的胆固醇吸收转运
• 5.4 鸡蛋整体摄入影响LDL类型的转变
• 5.5 其他因素
• 6 展望
• 7 选题学术思想
• 7.1 研究目的和意义
• 7.2 学术思路
• 7.3 研究路线
• 7.4 主要研究内容
• 7.4.1 鸡蛋胆固醇营养效果及主要代谢途径实验动物学研究
• 7.4.2 鸡蛋中调控胆固醇吸收代谢成分的找寻研究
• 7.4.3 鸡蛋脂质成分对胆固醇吸收代谢调控机理的研究
• 第二章 鸡蛋摄取对大鼠血脂水平及肝脏胆固醇代谢相关基因表达的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 原料
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器与设备
• 1.1.4 缓冲溶液配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 实验设计
• 1.2.2 各组大鼠饲料的制备与营养成分的测定
• 1.2.3 大鼠样品采集与处理
• 1.2.4 大鼠摄食量、体重及脏器比值的测定
• 1.2.5 大鼠肝脏、血液及粪便生化指标的测定
• 1.2.6 大鼠肝组织与胸主动脉病理学检查
• 1.2.7 大鼠肝胆固醇代谢相关基因mRNA表达量的测定
• 1.2.8 统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 各组大鼠饲料的营养成分比较
• 2.2 各组大鼠摄食量、体重变化及脏器比值变化
• 2.3 各组大鼠血脂、肝脂及粪脂水平变化
• 2.3.1 各组大鼠血脂水平变化
• 2.3.2 各组大鼠肝脂水平变化
• 2.3.3 各组大鼠粪脂水平变化
• 2.4 各组大鼠肝组织病理学变化
• 2.4.1 各组大鼠肝实图
• 2.4.2 各组大鼠肝HE切片图
• 2.5 大鼠肝胆固醇代谢相关基因mRNA表达量的变化
• 2.5.1 大鼠肝脏总RNA质量评价与RT-qPCR退火条件的优化
• 2.5.2 各组大鼠肝脏胆固醇代谢基因mRNA表达量的变化
• 2.6 鸡蛋摄入对健康SD大鼠肝脏胆固醇代谢通路的影响
• 3 小结
• 第三章 Caco-2细胞单层模型的建立与评价
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 Caco-2细胞株
• 1.1.2 主要试剂与耗材
• 1.1.3 主要仪器与设备
• 1.1.4 缓冲溶液配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 Caco-2细胞培养
• 1.2.2 Caco-2细胞单层模型的建立
• 1.2.3 Caco-2细胞生长曲线的制备
• 1.2.4 Caco-2细胞单层模型紧密性与完整性的鉴定
• 1.2.5 Caco-2细胞单层模型形态学观察
• 1.2.6 Caco-2细胞生长分化特征的鉴定
• 1.2.7 Caco-2细胞单层通透性的验证
• 1.2.8 数据处理与统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 Caco-2细胞生长曲线
• 2.1.1 接种浓度的选择
• 2.1.2 不同时间段Caco-2细胞生长情况
• 2.2 Caco-2细胞单层模型的紧密性与完整性
• 2.3 Caco-2细胞单层模型的形态学观察
• 2.4 Caco-2细胞单层模型的极化
• 2.5 荧光黄转运实验
• 2.6 Caco-2细胞单层模型的建立与转运实验注意事项
• 3 小结
• 第四章 胆固醇在Caco-2细胞单层模型中的体外转运研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 Caco-2细胞株
• 1.1.2 主要试剂与耗材
• 1.1.3 主要仪器与设备
• 1.1.4 缓冲溶液配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 Caco-2细胞单层模型的建立与验证
• 1.2.2 3H-胆固醇的测定
• 1.2.3 不同pH值下Caco-2细胞单层模型中的胆固醇转运实验
• 1.2.4 不同浓度下Caco-2细胞单层模型中的胆固醇转运实验
• 1.2.5 Ezetimibe添加后Caco-2细胞单层模型中的胆固醇转运实验
• 1.2.6 RT-qPCR实验
• 1.2.7 Western-blot实验
• 1.2.8 数据处理与统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 Caco-2细胞单层模型的验证
• 2.2 pH对胆固醇在Caco-2细胞单层模型转运的影响
• 2.3 浓度对胆固醇Caco-2细胞单层模型转运的影响
• 2.4 Eetimibe对胆固醇Caco-2细胞单层模型转运的影响
• 2.5 Ezetimibe对胆固醇吸收关键蛋白NPC1L1表达的影响
• 2.6 胆固醇在Caco-2细胞单层模型中转运类型的鉴定
• 3 小结
• 第五章 鸡蛋中调控Caco-2细胞胆固醇吸收转运成分的筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 Caco-2细胞株
• 1.1.2 主要试剂与耗材
• 1.1.3 主要仪器与设备
• 1.1.4 缓冲溶液配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 鸡蛋蛋白质的提取
• 1.2.2 鸡蛋蛋白质的体外胃肠模拟消化
• 1.2.3 鸡蛋候选因子的理化特性鉴定
• 1.2.4 候选因子对Caco-2细胞的毒性试验
• 1.2.5 鸡蛋各候选因子在Caco-2细胞单层模型中的摄取方案
• 1.2.6 鸡蛋各候选因子在Caco-2细胞单层模型中的转运方案
• 1.2.7 数据处理与统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 Caco-2细胞单层模型的验证
• 2.2 鸡蛋蛋白与磷脂的理化特性分析
• 2.3 鸡蛋候选因子对Caco-2细胞的毒性试验
• 2.4 鸡蛋中候选因子对Caco-2细胞单层中胆固醇摄取的影响
• 2.5 鸡蛋中候选因子对Caco-2细胞单层中胆固醇转运的影响
• 2.6 鸡蛋中调控胆固醇在Caco-2单层模型中转运的成分
• 3 小结
• 第六章 磷脂对胆固醇微胶束物理化学性质的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂与耗材
• 1.1.2 主要仪器与设备
• 1.1.3 缓冲溶液配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 微胶束化学成分分析
• 1.2.2 牛磺胆酸钠结合能力测定
• 1.2.3 胆固醇的溶解度测定
• 1.2.4 牛磺胆酸盐的溶解度测定
• 1.2.5 微胶束的分子量变化测定
• 1.2.6 数据处理与统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 微胶束化学成分分析
• 2.2 磷脂对其与牛磺胆酸钠结合能力的影响
• 2.3 磷脂对盐溶液中胆固醇溶解度的影响
• 2.4 磷脂对盐溶液中牛磺胆酸盐溶解度的影响
• 2.5 磷脂对微胶束分子量变化的影响
• 2.6 鸡蛋中磷脂对胆固醇微胶束物理化学性质的影响
• 3 小结
• 第七章 鸡蛋卵磷脂与神经鞘磷脂调控Caco-2细胞胆固醇吸收转运的分子机理研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 Caco-2细胞株
• 1.1.2 主要试剂与耗材
• 1.1.3 主要仪器与设备
• 1.1.4 缓冲溶液配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 Caco-2细胞单层模型的建立
• 1.2.2 磷脂脂肪酸的氧化与细胞毒性实验
• 1.2.3 鸡蛋卵磷脂与神经鞘磷脂在Caco-2细胞中的孵育
• 1.2.4 Caco-2细胞总RNA提取与RT-qPCR反应
• 1.2.5 Western-blot实验
• 1.2.6 数据处理与统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 磷脂脂肪酸氧化性与毒性评价
• 2.2 Caco-2细胞总RNA质量评价与RT-qPCR退火条件的优化
• 2.3 Caco-2细胞中胆固醇转运蛋白NPC1L1翻译与转录水平的变化
• 2.4 Caco-2细胞中胆固醇吸收代谢相关基因mRNA表达量的变化
• 2.4.1 Caco-2细胞中ABCG5与ABCG8 mRNA转录水平的变化情况
• 2.4.2 Caco-2细胞中ABCA1 mRNA转录水平的变化情况
• 2.4.3 Caco-2细胞中ACAT2与MTP mRNA转录水平的变化情况
• 2.4.4 Caco-2细胞中Caveolin 1与Annexin A2 mRNA转录水平的变化情况
• 2.4.5 Caco-2细胞中SREBP-1与SREBP-2 mRNA转录水平的变化情况
• 2.5 磷脂孵育后对Caco-2细胞中胆固醇吸收代谢通路的影响
• 3 小结
• 第八章 鸡蛋脂肪酸调控Caco-2细胞胆固醇吸收转运的分子机理研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 Caco-2细胞株
• 1.1.2 主要试剂与耗材
• 1.1.3 主要仪器与设备
• 1.1.4 缓冲溶液配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 Caco-2细胞单层模型的建立
• 1.2.2 鸡蛋脂肪酸的氧化与细胞毒性实验
• 1.2.3 鸡蛋脂肪酸在Caco-2细胞中的孵育
• 1.2.4 Caco-2细胞总RNA提取与RT-qPCR反应
• 1.2.5 Western-blot实验
• 1.2.6 数据处理与统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 脂肪酸氧化性与毒性评价
• 2.2 Caco-2细胞中胆固醇转运蛋白NPC1L1翻译与转录水平的变化
• 2.3 Caco-2细胞中胆固醇吸收代谢相关基因mRNA转录水平的变化
• 2.3.1 Caco-2细胞中ABCG5与ABCG8 mRNA转录水平的变化情况
• 2.3.2 Caco-2细胞中ABCA1 mRNA转录水平的变化情况
• 2.3.3 Caco-2细胞中ACAT2与MTP mRNA转录水平的变化情况
• 2.3.4 Caco-2细胞中Caveolin 1与Annexin A2 mRNA转录水平的变化情况
• 2.3.5 Caco-2细胞中SREBP-1与SREBP-2 mRNA转录水平的变化情况
• 2.4 脂肪酸孵育后对Caco-2细胞中胆固醇吸收代谢通路的影响
• 3 小结
• 第九章 结论与展望
• 1 结论
• 2 创新性
• 3 延续研究计划
• 参考文献
• 附录
• 致谢