几种淡水鱼轻酶解肌球蛋白重链基因的cDNA克隆及结构解析

论文摘要

肌球蛋白约占鱼骨骼肌肌原纤维蛋白质的50%以上,能和肌动蛋白结合形成细胞运动如胞质分裂和肌肉收缩等所需的物质,有“分子马达”之美誉。肌球蛋白分子由两条重链亚基和四条轻链亚基组成。分为两个功能区域:N-端的S1形成球状头部,具有ATPase活性和与肌动蛋白结合的能力;余下的杆状区域呈α-双螺旋结构,其C-端为轻酶解肌球蛋白（light meromyosin, LMM）,具有在生理性离子强度下形成粗丝的能力,并与鱼肌肉蛋白质的凝胶形成能力有关。鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）、鳊鱼（Parabramis pekinensis）、鲫鱼（Carassius auratus）和鳙鱼（Grammonoides opisthodom）是淡水鱼中最为常见的鲤科鱼类,因具有低值、高产的特点,一直以来是加工利用的主要对象。迄今为止,国内关于淡水鱼类肌肉蛋白质分子生物学方面的研究报道很少。据此,本文选择上述四种淡水鱼为研究对象,在分子基因水平上对它们骨骼肌轻酶解肌球蛋白展开了一定的研究。早期的研究中,我们已经通过3′-RACE从冬季和夏季鲢鱼的骨骼肌中分离到两种肌球蛋白重链同工型基因,分别命名为低温型（sc-w）和高温型（sc-s）,但它们仅包含了3′端约550bp的核苷酸序列;另外,利用3′端的序列信息,并通过Long-PCR已扩增到编码这两种肌球蛋白重链同工型基因的全长cDNA。本文以两种同工型基因全长cDNA为模板,通过对两种同工型基因5′-端的延伸,获得了编码鲢鱼轻酶解肌球蛋白（LMM）的全长cDNA序列及推断的氨基酸序列。另一方面,采用RT-PCR和3′-RACE法对鳊、鲫、鳙鱼3′端的部分轻酶解肌球蛋白重链cDNA基因进行了克隆和测序,这些基因包括了部分3′-翻译区和全部3′-非翻译区。通过生物信息学软件对上述获得的轻酶解肌球蛋白的结构进行了深入的解析,并通过分子系统树进一步对LMM的基因和功能歧化进行了分析。研究结果表明:sc-w与sc-s之间在全长LMM的氨基酸序列上显示91.8%的同源性;sc-w与已经报道的草鱼（Ctenopharyngodon idella）低温型（gc10）有96.9%的高同源性;sc-s则与草鱼中间型（gcI）和高温型（gc30）分别显示了98.5%和97.1%的同源性。另一方面,将来自冬季的鳊、鲫、鳙鱼与其它鱼类部分LMM重链同工型的氨基酸序列进行比较,发现与低温型的鲢鱼sc-w、草鱼gc10和鲤鱼（Cyprinus carpio）c10之间显示高的同源性（97.1%-99.2%）。在对全长LMM结构解析中,发现低温型的sc-w和gc10与其它LMM相比,在初级结构上展现的特有变异主要发生在21个氨基酸残基位点,其中9个属保守性残基。鲢鱼两种LMM的初级结构的氨基酸序列均显示了一个高度保守的、具有典型α-螺旋结构蛋白质的特征,即7个残基的重复排列（a、b、c、d、e、f、g）n,且a、d位点主要由疏水性残基占据,sc-s所含的疏水性残基（31.1%）略高于sc-w（30.9%）,似乎表明前者相对于后者具有更为稳定的α-双螺旋结构;双螺旋结构表面的b、c、e、f、g位点充满了带电残基,与粗丝结构的形成有关。鳊、鲫、鳙鱼的部分轻酶解肌球蛋白重链的氨基酸序列均显示了亲水性模式,但鳊鱼和鳙鱼相对于鲫鱼在5个区域展现了更高的亲水值。本文研究结果初步证明了鲢、鳊、鲫、鳙几种鲤科鱼类LMM同工型之间在初级结构上展现的差异可能导致了栖息于不同环境温度下的鱼骨骼肌肌球蛋白具有不同的凝胶形成特性。分子系统树的分析结果表明:来自高温栖息环境的淡水鱼类的LMM之间享有更近的基因距离,而来自低温栖息环境的淡水鱼类的LMM之间享有较近的基因距离,由此进一步证明了鱼类栖息环境温度对其肌球蛋白同工型的基因和功能歧化的影响。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 我国淡水鱼资源及其利用现状
• 1.2 淡水鱼栖息环境特点及其对肌肉蛋白质功能性质的影响
• 1.3 肌球蛋白概述
• 1.3.1 鱼类肌肉组织与蛋白组成
• 1.3.2 肌球蛋白的结构特征
• 1.3.3 肌球蛋白的功能性质
• 1.4 鱼类肌球蛋白重链的研究现状
• 1.4.1 淡水鱼肌球蛋白重链同工型
• 1.4.2 淡水鱼肌球蛋白热稳定性的变化与环境温度之间的关系
• 1.4.3 肌球蛋白重链在鱼糜凝胶过程中的作用
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第二章 实验材料和一般方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验鱼
• 2.1.2 仪器和设备
• 2.1.3 实验试剂
• 2.2 主要试剂的配制
• 2.3 引物设计
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 琼脂糖凝胶电泳
• 2.4.2 试剂盒割胶纯化DNA
• 2.4.3 感受态细胞制备
• 2.4.4 连接反应
• 2.4.5 重组质粒的转化
• 2.4.6 蓝白斑筛选和PCR 快速鉴定重组菌落
• 2.4.7 DNA 测序
• 2.5 数据分析
• 第三章 几种鲤科鱼类轻酶解肌球蛋白重链基因的cDNA 克隆
• 3.1 实验方法
• 3.1.1 总RNA 提取和第一股cDNA 合成
• 3.1.2 冬夏季鲢鱼轻酶解肌球蛋白重链基因的全长cDNA 扩增
• 3.1.3 鳊、鲫、鳙鱼轻酶解肌球蛋白重链基因的3′-RACE 扩增
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 总RNA 的琼脂糖凝胶电泳检测结果
• 3.2.2 鲢鱼轻酶解肌球蛋白重链基因全长cDNA 的扩增结果
• 3.2.3 基于3′-RACE 法的鳊、鲫、鳙鱼轻酶解肌球蛋白重链基因的扩增结果
• 3.2.4 基于PCR 法的阳性克隆检测结果
• 3.2.5 测序结果及核苷酸同源性比较
• 3.3 本章小结
• 第四章 几种鲤科鱼类轻酶解肌球蛋白重链的氨基酸序列分析及结构解析
• 4.1 冬夏季鲢鱼轻酶解肌球蛋白重链同工型的氨基酸序列分析及结构解析
• 4.1.1 基于cDNA 序列的冬夏季鲢鱼轻酶解肌球蛋白重链同工型的氨基酸序列推断及其同源性比较
• 4.1.2 冬夏季鲢鱼轻酶解肌球蛋白重链同工型的初级结构组成特点
• 4.1.3 冬夏季鲢鱼轻酶解肌球蛋白重链同工型α-双螺旋结构的28-残基重复排列模式
• 4.2 鳊、鲫、鳙鱼的部分轻酶解肌球蛋白重链的氨基酸序列分析及结构解析
• 4.2.1 鳊、鲫、鳙鱼的部分轻酶解肌球蛋白重链氨基酸序列的同源性比较
• 4.2.2 鳊、鲫、鳙鱼的部分轻酶解肌球蛋白重链的疏水性分析
• 4.3 基于部分轻酶解肌球蛋白重链氨基酸序列的分子系统树分析
• 4.4 本章小结
• 第五章 结论和展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢