乌司他丁对失血性休克大鼠肺细胞间粘附分子-1的影响及其肺保护作用

论文摘要

当机体受到各种严重感染、创伤、失血、休克、烧伤、胰腺炎及再灌注损伤等因素刺激时,可以形成全身炎症反应综合症（Systemic Inflammatoromesyndrome-SIRS）,在这种情况下,即使原发因素消除或减弱,炎症反应仍可继续并最终导致多器官功能障碍综合症（Multiple Organ DysfunctionSyndrome-MODS）。其中呼吸功能障碍在MODS中发病率高,出现时间早,一般在发病后24-72h,临床表现为急性肺损伤（Acute Lung Injury-ALI）和急性呼吸窘迫综合症（Acute Respiratory Distress-ARDS）,发生率高达40%-80%。ALI的治疗目标包括:改善肺氧合功能,纠正缺氧,生命支持,保护器官功能,预防并发症和治疗基础疾病。失血性休克由于机体有效循环血量骤然减少和组织低灌注,及随后的缺血/再灌注损伤可导致ALI,作为临床常见急症受到越来越多的关注。既往的研究表明,白细胞尤其是中性粒细胞（Polymorphonuclearneutrophil.PMN）既是引发SIRS的主要细胞,又是缺血/再灌注损伤主要参与者,成为介导休克后肺损伤的主要效应细胞,与内皮细胞（Endothelial Cell-EC）上粘附分子的粘附过程构成了损伤的关键环节。细胞间粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-ICAM-1）是EC上免疫球蛋白超家族成员,其表面受体可与PMN上整合素配体结合。正常情况下其表达和活化受到限制,在刺激因素（IL-1、TNF、LPS）作用下表达上调,上调的ICAM-1一方面促进PMN的粘附,导致PMN跨血管内皮、释放活性物质造成组织损伤。另一方面促发炎症介质的“瀑布样”释放。细胞因子的级联瀑布效应进一步吸引和激活PMN释放更多的蛋白酶和自由基,构成一个级联放大的网络,形成恶性循环,因而ICAM-1成为粘附过程的关键分子。因此,如何早期抑制粘附分子的激活,减弱PMN的趋化、黏附、释放活性物质减轻机体炎症反应、防止EC的损伤,从而预防ALI的发生发展,成为近年来人们关注的主要目标之一。乌司他丁（Ulinary Trypsin Inhibitor-UTI）是一种来源于人体的高效广谱蛋白酶抑制剂,对胰蛋白酶、纤溶酶、中性粒细胞弹性蛋白酶具有较强的抑制作用。UTI本身来源于人体,无免疫原性,安全性高,是一种较理想的外源性蛋白酶抑制剂,早期被广泛应用于急性胰腺炎的治疗,其器官保护作用的研究逐渐成为热点。在对于UTI的基础研究中,采用的动物模型主要集中在油酸、内毒素、胃液吸入、急性胰腺炎等。临床研究主要是针对细胞因子的变化来观察其器官保护作用。有关UTI对失血性休克所致肺损伤的作用研究较少。蒋龙元等人研究发现,UTI可抑制炎症介质的释放而对缺血/再灌注损伤肺起保护作用。王刚等人在兔创伤失血性休克研究中,采集了休克前、休克中、复苏后2h、4h静脉血测定细胞因子（TNF-a,IL-6）和可溶性细胞见粘附分子—1（SICAM-1）,结果显示:创伤休克组TNF-a的变化大于UTI组,且在复苏后4h变化最明显,2h后SICAM-1的变化在创伤休克组和UTI组均不明显,但在复苏后4h显著升高,而UTI组又明显高于创伤休克组。本研究通过测定ICAM-1、MPO活力、肺组织W/D比,并观察肺组织病理学变化,探讨UTI对失血性休克大鼠ICAM-1的影响及其肺保护作用的可能机制。材料和方法1、实验动物和分组:成年雄性大鼠24只,SPF级,体重350～450g,由广东医学实验动物中心提供,随机分为对照组（C组）、休克组（H组）和乌司他丁组（U组）,每组8只。2、动物麻醉:实验前12h禁食,自由饮水。30g/L戊巴比妥钠腹腔注射,麻醉后仰卧位于手术台上。术中以动物出现体动为麻醉清醒标准,以后每隔1小时股静脉注射戊巴比妥钠15mg/kg维持麻醉状态。3、失血性休克模型的建立:待动物麻醉后行股动、静脉穿刺并置管,动脉用于监测MAP和放血,静脉用于回输血液。C组仅行动、静脉穿刺置管。另两组上述操作完成后稳定10min,由股动脉缓慢抽取血液2.0ml·（kg·min）-1（需10 min）至MAP（40±5）mmHg水平,并间断回输或放血维持此血压60min建立失血性休克模型。U组复苏开始前静脉注入UTI 50000U/kg,H组输入等量的生理盐水,两组均回输全部失血和等量的乳酸林格液进行复苏（需30min）。复苏后4h快速放血（约需2min）处死实验动物取肺组织。取左肺约100g投入液氮中,再转移至-80℃冰箱冻存备检。4、指标测定:4.1、肺组织ICAM-1:采用免疫组化法检测:一抗为1:200ICAM-1单克隆抗体,二抗为辣根酶标记羊抗兔IgG,阴性对照标本除以PBS代替一抗外,其他步骤与被测标本相同,阳性反应为胞浆中出现棕黄色颗粒。在盲法下对切片进行观察并作半定量分析,根据细胞染色的深浅评分。无染色0分,淡黄色1分,棕黄色2分,深棕黄色3分。再以视野中显色细胞所占的比例（取10个视野的平均值）评分:＜20%0分,20～40%1分,40～60%2分,＞60%3分。将两项评分的乘积作为积分数,根据积分将ICAM-1表达分为四级:0分阴性,1～3分弱阳性,4～6分阳性,＞6分强阳性。4.2、MPO检测:取冻存肺组织制成5%组织匀浆,按试剂盒说明书进行检测。用UV-2600A型紫外分光光度计在460 nm处通过比色测定该产物的生成量,依MPO活力单位/克湿片=（测定管OD-对照管OD）/（11.3×取样量）公式推算出肺组织MPO活力。4.3、W/D比值测定:取右肺上叶,滤纸吸干肺表面水分,精确称重后放入烤箱72h（60℃）,测定W/D比值;4.4、肺组织病理学观察:取右肺中叶,多聚甲醛浸泡固定,常规石蜡包埋切片,HE染色,光学显微镜（×200,×400）观察肺组织病理学改变。5、统计学处理:采用SPSS13.0统计软件处理,计量资料以均数±标准差（（?）+S）表示。体重、基础血压、放血量、MPO活力、W/D比值,首先进行方差齐性检验,采用One-Way-ANOVA方法,方差不齐者采用welch法。多重比较采用LSD法或Dunnett′s T3法。P＜0.05为差异有统计学意义。免疫组化积分值采用完全随机设计多个样本比较的Kruskal-Wallis H检验,P＜0.05为差异有统计学意义。结果三组动物体重及基础MAP差异无统计学意义（P=0.730;P=0.859）。H组和U组放血量差异无统计学意义（P=0.850）。1、ICAM-1:方差齐性检验显示ICAM-1免疫组化积分值方差不齐,采用Welch法检验,多重比较采用Dunnett′s T3法。各组ICAM-1免疫组化积分值比较有统计学差异。C组肺泡间隔、血管EC表面和肺泡上皮细胞无染色,ICAM-1表达阴性,评分为0;U组肺泡间隔、血管EC和肺泡上皮细胞有黄色或棕黄色颗粒,肺组织ICAM-1表达呈弱阳性（0,2,2,1,2,2,1,1）;H组肺泡间隔、血管EC和肺泡上皮细胞均有棕黄色或深棕色颗粒,ICAM-1表达呈强阳性。（评分4,6,2,4,6,9,6,6）（x2=19.966,P=0.000）2、MPO活性:方差齐性检验显示MPO活力值方差不齐,采用Welch法检验,多重比较采用Dennett’s T3法。C组MPO（1.60±0.8892）低于U组（2.14±0.18）和H组（2.72±0.21）,U组低于H组,各组比较有统计学差异（F=86.874,P=0.00）。3、W/D比:方差齐性检验显示W/D比值方差不齐,采用Welch法检验,多重比较采用Dennett’s T3法。C组W/D比（4.76±0.25）低于U组（5.20±0.27）和H组（5.51±0.20）,U组低于H组,差异有统计学意义（F=19.223,P=0.00）。4、光镜观察:C组肺组织结构完整,肺间质无水肿、炎症,肺泡大小形态均匀;H组肺组织弥漫性充血、出血,肺泡结构破坏,肺泡间隔增宽,炎症细胞聚集,肺泡腔内水肿液积聚;U组肺泡结构破坏及炎症细胞聚集程度均比H组明显减轻,仅有很少量的白细胞浸润。结论在失血性休克状态下,UTI可减少大鼠肺组织ICAM-1的表达,抑制MPO活性,降低肺含水量,减轻肺组织病理学改变,从而减轻失血性休克大鼠肺组织损伤。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 第三章 结果
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附图
• 综述
• 缩略语
• 成果
• 致谢
• 研究生毕业论文统计学审稿证明