两栖单顶孢菌（Monacrosporium Janus）菌寄生性的酶学机理研究

论文摘要

本论文对食线虫真菌两栖单顶孢（Monacrosporium janus）菌寄生的酶学机理进行了研究。 平板对峙法培养两栖单顶孢和核盘菌,表明两栖单顶孢对核盘菌生长有抑制作用。在以菌核粉为唯一碳源的液体培养基中连续培养两栖单顶孢并连续测定各酶的活性,结果只有葡聚糖酶的活性较为显著且随着培养时间的延长酶活性明显变化。说明葡聚糖酶在两栖单顶孢的菌寄生过程中起重要作用。 从培养基种类、培养时间和初始pH值三方面对两栖单顶孢产葡聚糖酶的条件进行了优化。结果表明以麸皮粉为诱导物、28℃ 180rpm振荡培养4天、初始pH值为6时产酶量最大。 通过硫酸铵沉淀、Sephadex G-25凝胶过滤脱盐和阴离子交换柱层析对葡聚糖酶进行了分离纯化,得到了两种葡聚糖同工酶。SDS-PAGE电泳检验结果表明,一种同工酶得到了纯化,定名为MjGLU1,分子量为33KD左右,其氨基端氨基酸序列为NH2-N-P-C-Y-L-G-S-F-Q-T。另一种同工酶得到了部分纯化。 对葡聚糖酶MjGLU1的特性进行研究,结果表明该葡聚糖酶的最适反应温度为70℃,最适反应pH为5.0,低于70℃和pH5-6时该酶比较稳定,Mn2+、Co2+对MjGLU1活性有促进作用,Cu2+、Fe3+对MjGLU1活性有强烈的抑制作用。该酶对昆布多糖底物的Km值为0.17mg/ml。 生测实验表明,两栖单顶孢所产生的葡聚糖酶粗酶液可明显抑制立枯丝核菌菌丝的生长,使其膨胀破裂,表明葡聚糖酶在两栖单顶孢的菌寄生过程中起重要作用。但对其中一种得到纯化的葡聚糖同工酶的生测结果表明,其抑菌效果不明显,对这一现象的产生本文进行了深入的讨论。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 引言
• 第二章 菌寄生过程中相关酶的筛选
• 材料
• 方法
• 一、PDA平板对峙培养观察菌落互作
• 二、平板透明圈法检测酶活性
• 三、比色法测定酶活性
• 四、蛋白质含量测定
• 结果
• 一、平板对峙培养
• 二、平板法检测几丁质酶和葡聚糖酶活性
• 三、比色法测定相关酶活性
• 讨论
• 第三章 葡聚糖酶的纯化
• 材料
• 方法
• 一、两栖单项孢产葡聚糖酶条件的测定
• 二、葡聚糖酶的纯化
• 三、蛋白质的氨基端氨基酸序列分析
• 结果
• 一、两栖单顶孢产葡聚糖酶条件的测定
• 二、葡聚糖酶的纯化
• 三、葡聚糖酶MjGLU1的氨基端氨基酸序列
• 讨论
• 第四章 葡聚糖酶的性质研究
• 材料
• 方法
• 一、温度对葡聚糖酶MjGLU1的影响
• 二、pH对葡聚糖酶MjGLU1的影响
• 三、金属离子对葡聚糖酶MjGLU1酶活的影
• 四、葡聚糖酶MjGLU1的Km值测定
• 五、葡聚糖酶的抗病原真菌的作用
• 结果
• 一、温度对葡聚糖酶MjGLU1的影响
• 二、PH对葡聚糖酶MjGLU1的影响
• 三、金属离子对葡聚糖酶MjGLU1活性的影
• 四、葡聚糖酶MjGLU1的Km值测定
• 五、葡聚糖酶对病原菌的作用
• 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢