广东省湛江市第二人民医院广东湛江524003
【摘要】目的：进一步探讨联合酸枣仁和黄连水煎剂应用于对氯苯丙氨酸（PCPA）致失眠模型小鼠的作用机理。方法：将40只SPF级健康的昆明雌性小鼠随机分为4组，每组10只：空白对照组（给予生理盐水），模型对照组（给予生理盐水），天王补心混悬液组（阳性组，给予1.5g/kg，灌胃给药），酸枣仁-黄连水煎剂组（给药组，给予5g/kg，灌胃给药)。除空白对照组外，其余3组小鼠均腹腔注射PCPA混悬液300mg/kg，每隔一天腹腔注射1次，共注射2次。待给药结束后，在冰上迅速取出各组小鼠的脑组织，接着通过酶联免疫吸附试验法（Elisa）检测各组小鼠脑组织5-羟色胺（5-HT）和γ-氨基丁酸（GABA）的含量。结果：与模型组比较，天王补心混悬液组和酸枣仁-黄连水煎剂组的5-HT含量显著升高（P=0.000017；P=0.000009），然而，GABA含量显著降低（P=0.00057；P=0.00075），差异均有统计学意义，此外，天王补心混悬液组和酸枣仁-黄连水煎剂组的5-HT和GABA含量均无显著性差异，均与空白对照组相差不大。结论：酸枣仁和黄连联合水煎剂应用于治疗PCPA致失眠模型小鼠的机制可能是与升高脑组织中的5-HT和降低GABA的水平有关。
【关键词】酸枣仁；黄连；联合应用；PCPA致失眠模型小鼠；酸枣仁-黄连水煎剂
【中图分类号】R285.5【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2016）12-037-02
失眠是指无法入睡或无法保持睡眠状态,导致睡眠不足。由于社会节奏的加快和工作压力的不断增大，失眠已成为困扰人们生活的严重疾病。中药酸枣仁或黄连都具有独特镇静催眠作用，无毒副作用，常被应用于临床治疗神经衰弱和失眠[1]。研究发现酸枣仁提取物和乙醇提取物能明显缩短小鼠的入睡时间，显著延长睡眠持续时间，表明酸枣仁提取物能明显改善小鼠的睡眠[2]。黄连可能通过抑制下丘脑-垂体-肾上腺素轴（HPA），增加对氯苯丙氨酸（PCPA）小鼠失眠模型下丘脑中5-羟色胺（5-HT）和去甲肾上腺素（NE）的含量，来发挥一定的镇静、催眠的作用[1]。另一研究表明黄连阿胶汤治疗失眠症的作用与5-HT关系明显，而与γ-氨基丁酸（GABA）关系不明显，即其治疗失眠的机制可能与5-HT的含量有关[3]。而至于将其两者联合的酸枣仁和黄连水煎剂对失眠的作用机制仍不清楚。因此，本实验为了进一步明确酸枣仁和黄连联合应用于失眠的作用机理，我们检测了其联用后对PCPA致失眠小鼠的脑组织中5-HT和GABA含量的影响。
1材料与仪器
1.1动物SPF级健康雌性昆明小鼠40只，体重（18-22g），由广东省实验动物监测所提供，实验动物生产许可证号SCXK（粤）2008-0020。实验前先将动物适应性饲养3d，自由饮水、进食标准小鼠饲料；动物房内适度通风，光照12h，室温25℃，温度55%±5%。
1.2药物与试剂酸枣仁和黄连均购自湛江市第二中医院；天王补心丸(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂生产，浓缩丸，批号Z11020140)。对氯苯丙氨酸（Sigma）；5-HT、和GABA酶联免疫吸附(Elisa)测定试剂盒(北京诚林生物科技有限公司提供)；DHL-A(3+1)型北京东华原十功能煎药机(北京东华原医疗设备有限公司)；Multiskan352型MS酶标仪(芬兰LABSYSTEM公司)。
2方法
2.1试药制备精确称取酸枣仁、黄连各30g，加水15倍量，浸泡30min后，二煎加水13倍量，煎煮20min，4层纱布分别过滤，合并两次水煎液，浓缩至生药0.5g/mL，冷却后置于4℃冰箱内备用。天王补心混悬液的制备，临用前用蒸馏水制成0.15g/mL混悬液，置于4℃冰箱内备用。
2.2模型建立和分组将40只SPF级健康的昆明雌性小鼠随机分为4组，每组10只：空白对照组（给予生理盐水），模型对照组（给予生理盐水），天王补心混悬液组（阳性组，给予1.5g/kg，灌胃给药方式），酸枣仁-黄连水煎剂组（给药组，给予5g/kg，灌胃给药方式)。除空白对照组外，其余3组小鼠均腹腔注射PCPA混悬液300mg/kg，隔日1次，共注射2次。造模小鼠出现毛发变黄，易惊觉，记忆减退，食量减少，体重变轻等改变，表示造模成功。之后开始分别按剂量给药治疗。
2.3检测指标给药结束后，脱颈椎处死小鼠，冰上快速取出脑组织，在冰冷生理盐水中洗去血液，组织称重后，在冰浴条件下充分匀浆，离心(3000r/min，10min)，取上清液，按ELISA试剂盒按说明书处理后，在酶标仪450nm处进行检测5-HT和GABA含量。
2.4统计学分析各组数据采用表示，运用SPSS13.0统计软件进行分析，采用自身前后对照，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
3结果
给药治疗后，各组的Elisa结果显示，与模型组比较，天王补心混悬液组和酸枣仁-黄连水煎剂组的5-HT含量显著升高（P=0.000017；P=0.000009），然而，GABA含量显著降低（P=0.00057；P=0.00075），差异均有统计学意义。此外，天王补心混悬液组和酸枣仁-黄连水煎剂组的5-HT和GABA含量均无显著性差异，均与空白且相近。
4讨论
近年来多用中药来干预睡眠剥夺的研究，由于中药作用较持久，毒副作用较少，因此具有较好的应用前景。研究表明，与睡眠关系最大的神经递质分别是5-HT和GABA[4]。其中，GABA是哺乳动物神经系统中重要的抑制性神经递质，对神经元有抑制性作用，对哺乳动物具有镇静、催眠、抗焦虑等功能[5]。神经递质5-HT可能参与痛觉、睡眠和体温等生理功能的调节，研究表明脑内5-HT浓度的升高，会使机体产生疲劳感和睡意[6]。
本实验采用国内外较为公认的PCPA腹腔注射所导致失眠模型[7]，PCPA是5-HT合成抑制剂，造成睡眠昼夜节律消失，达到完全失眠。造模后，相对空白对照组小鼠，给予PCPA的小鼠出现明显的失眠特征，活动频繁，对外界的声、光等刺激异常敏感，兴奋性增高，攻击性增强，昼夜节律紊乱，白天也活动不止，表明造模成功。另外，本实验以天王补心丸为阳性对照，结果显示，天王补心混悬液组和酸枣仁-黄连水煎剂组的5-HT含量均比模型对照组高（P<0.01），GABA含量比模型对照组低（P<0.05）。此外，酸枣仁-黄连水煎剂组的5-HT和GABA含量与天王补心混悬液组比较均无显著性差异。结果提示，虽然黄连单独或与阿胶联合使用时，其对GABA含量没有影响；而将黄连与酸枣仁联合应用，既能提高PCPA致失眠模型小鼠脑组织中的5-HT水平，也能抑制GABA的水平，更能改善失眠小鼠的睡眠效果。因此，我们推测酸枣仁和黄连联合水煎剂应用于治疗PCPA致失眠模型小鼠的机制可能是通过升高脑组织中5-HT和降低GABA的水平有关。
参考文献
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基金项目：海南省自然科学基金（编号：20168266）
作者简介：陈丹（1987-），女，汉族，广东阳江，中药师，E-mail：418917224@qq.com